ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ: различия между версиями

 
 
Строка 71: Строка 71:
 
Некоторые вирусы адсорбируются на эритроцитах, но не вызывают их агглютинации. Для их выявления можно использовать реакцию непрямой гемагглютинации. Она основана на агглютинации «нагруженных» вирусом эритроцитов специфической по отношению к этому вирусу сывороткой. Этот метод используют в основном для титрования сывороток.
 
Некоторые вирусы адсорбируются на эритроцитах, но не вызывают их агглютинации. Для их выявления можно использовать реакцию непрямой гемагглютинации. Она основана на агглютинации «нагруженных» вирусом эритроцитов специфической по отношению к этому вирусу сывороткой. Этот метод используют в основном для титрования сывороток.
  
[[РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА|Реакция связывания комплемента]] (см.) пригодна для титрования как вирусов (точнее комплементсвязывающих вирусных антигенов), так и антител. Принципиально РСК с вирусами не отличается от таковой с бактериальными и прочими антигенами. Различия имеются лишь в способе приготовления антигенов. В качестве вирусных антигенов могут служить кровь, носоглоточные смывы, моча, фекалии больных, взвеси инфицированных органов, отдельные части зараженных куриных эмбрионов и выращенный в клеточных культурах вирус. Наиболее пригодны культуральные антигены. Взвеси зараженных органов перед использованием многократно замораживают и оттаивают, соединяют с равным объемом эфира или хлороформа, встряхивают 1—2 часа, после чего выдерживают 18—20 час. при t° 4°, вновь замораживают, оттаивают и осветляют центрифугированием. Для получения сывороток не следует иммунизировать животных вирусом, культивированным в том же субстрате, что и антиген для реакции. В зависимости от целей титрования соединяют двукратные разведения антигена с определенной дозой сыворотки или, наоборот, двукратные разведения сыворотки с одной дозой антигена. Контакт антигена, сыворотки и комплемента осуществляют в течение 1 часа при t° 37° или 18 час. при t° 4—6°. После добавления гемо-системы материал инкубируют 30 мин. при t° 37°. Оценку результатов производят по общим правилам.
+
[[РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА|Реакция связывания комплемента]] (см.) пригодна для титрования как вирусов (точнее комплементсвязывающих вирусных антигенов), так и антител. Принципиально РСК с вирусами не отличается от таковой с бактериальными и прочими антигенами. Различия имеются лишь в способе приготовления антигенов. В качестве вирусных антигенов могут служить кровь, носоглоточные смывы, моча, фекалии больных, взвеси инфицированных органов, отдельные части зараженных куриных эмбрионов и выращенный в клеточных культурах вирус. Наиболее пригодны культуральные антигены. Взвеси зараженных органов перед использованием многократно замораживают и оттаивают, соединяют с равным объемом эфира или хлороформа, встряхивают 1—2 часа, после чего выдерживают 18—20 час. при t° 4°, вновь замораживают, оттаивают и осветляют центрифугированием. Для получения сывороток не следует иммунизировать животных вирусом, культивированным в том же субстрате, что и антиген для реакции. В зависимости от целей титрования соединяют двукратные разведения антигена с определенной дозой сыворотки или, наоборот, двукратные разведения сыворотки с одной дозой антигена. Контакт антигена, сыворотки и комплемента осуществляют в течение 1 часа при t° 37° или 18 час. при t° 4—6°. После добавления гемосистемы материал инкубируют 30 мин. при t° 37°. Оценку результатов производят по общим правилам.
  
 
Существуют методы титрования вирусов и антител, основанные на индикации вируса в зараженных клетках культуры флюоресцирующими антителами, а также ряд других, которые применяют довольно редко.
 
Существуют методы титрования вирусов и антител, основанные на индикации вируса в зараженных клетках культуры флюоресцирующими антителами, а также ряд других, которые применяют довольно редко.
Строка 95: Строка 95:
  
  
'''Библиография:''' Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974, библиогр.; Лурия G. Е. и Д а р н e л л Дж. Е. Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970, библиогр.; Методы вирусологии и молекулярной биологии, пер. с англ., М., 1972; П ш e н и ч-н о в В. А., Семенов Б.Ф. иЗезе-р о в Е. Г. Стандартизация методов вирусологических исследований, М., 1974, библиогр.; Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней, под ред. П. Ф. Здродовского и М. И. Соколова, М., 1965; Соколов М. И., С и н и ц к и й А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.
+
'''Библиография:'''  
 +
 
 +
[https://search.rsl.ru/ru/record/01007146793 Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974, библиогр.];
 +
 
 +
Лурия G. Е. и Дарнелл Дж. Е. Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970, библиогр.; Методы вирусологии и молекулярной биологии, пер. с англ., М., 1972; Пшеничнов В. А., Семенов Б.Ф. и Зезеров Е. Г. Стандартизация методов вирусологических исследований, М., 1974, библиогр.; Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней, под ред. П. Ф. Здродовского и М. И. Соколова, М., 1965; Соколов М. И., Синицкий А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.
 +
 
  
 
''Э. P. Пилле.''
 
''Э. P. Пилле.''
 
[[Category:Том 4]]
 
[[Category:Том 4]]

Текущая версия на 2019-10-12T23:21:14

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ — исследования, проводимые с целью диагностики вирусных инфекций, изучения соответствующих возбудителей, их распространения в природе, а также при производстве вирусных препаратов. В вирусологических лабораториях (см.) мед. профиля изучают как вирусы человека, так в ряде случаев и вирусы животных (напр., проводят диагностику бешенства у собак, обследование животных, используемых для производства вирусных препаратов). Методы исследования тех и других сходны.

Одним из основных этапов В. и. является выделение вирусов. При выделении вирусов от людей используют кровь, различные секреты и экскреты, кусочки органов. Наиболее часто кровь исследуют при арбовирусных заболеваниях. Используется цельная дефибринированная или Гемолизированная кровь, отдельные ее элементы или сгустки (на поздних стадиях заболевания). Вирусы бешенства, эпид, паротита, простого герпеса могут быть обнаружены в слюне. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа, кори, пситтакоза, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы также обнаруживаются аденовирусы. Смыв берут путем полоскания носа и глотки (отдельно) и промывания конъюнктивы изотоническим раствором хлорида натрия. Можно протирать носовые ходы и заднюю стенку глотки тампонами, смоченными бульоном. Нестерильный материал обрабатывают антибиотиками (по 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл) в течение 30 мин. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено- и реовирусы. Пробы разводят 1:10 фосфатным буфером, центрифугируют дважды по 20 мин. при 8000 об I мин. Антибиотики прибавляют, как указано выше. Реже для В. и. берут содержимое пустул (при оспе, ветрянке, герпесе) и пунктаты органов (при венерической лимфогранулеме). Секционный материал следует брать как можно скорее после гибели организма. Его хранят до момента исследования при t°—20° и ниже. Для проведения В. и. ткань измельчают (растирают) и готовят 10—20% взвесь на изотоническом растворе хлорида натрия или питательной среде для клеточных культур. Ее центрифугируют 20 мин. при 1500 об/мин; надосадочную жидкость используют для дальнейшего исследования.

С целью выделения вирусов заражают лабораторных животных, эмбрионы птиц, клеточные и тканевые культуры. Животные оказываются пригодными в том случае, если вирус вызывает у них четкие клинические симптомы заболевания или патологоанатомические изменения (напр., параличи, пневмонию и т. п.). От тропизма вируса зависит эффективность того или иного пути введения материала. Широко применяют заражение под кожу, внутрибрюшинно и внутривенно. Нейротропные вирусы выявляют при заражении животных в полушария головного мозга (арбовирусы, вирус бешенства и др.), зрительный бугор (вирус полиомиелита в опытах на обезьянах), спинной мозг. Вирусы оспы и герпеса можно обнаружить путем нанесения материала кроликам на скарифицированную роговицу. Некоторые вирусы легко выявить при инокуляции в переднюю камеру глаза (напр., вирус гепатита собак в опыте на щенках). Для изучения возбудителей респираторных инфекций обычно применяют интраназальное заражение животных (закапывание материала в нос наркотизированным животным или введение его в виде аэрозоля в специальной камере). В пищеварительный тракт материал вводят с пищей или через рот тупой иглой. При изучении некоторых онкогенных вирусов применяют метод заражения золотистых хомячков в слизистую оболочку защечных мешков.

Ко многим вирусам новорожденные животные и сосунки восприимчивее половозрелых особей. Мышей-сосунков широко используют для выделения арбовирусов и вирусов Коксаки (после заражения в мозг). Некоторые аденовирусы способны индуцировать опухоли при подкожном заражении новорожденных золотистых хомячков. Изучение ряда вирусов птиц проводят на цыплятах первых дней жизни.

Рис. 1. Оспины вируса вакцины на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона.
Рис. 1. Оспины вируса вакцины на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона.

Использование куриных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Их недифференцированные ткани обладают широким спектром чувствительности в отношении многих вирусов. О наличии инфекции судят по гибели эмбрионов, появлению изменений (оспин) на хорион-аллантоисной оболочке (рис. 1), накоплению в эмбриональных жидкостях гемагглютининов и комплемент-связывающего вирусного антигена. Заражают эмбрионы на хорионаллантоисную оболочку (в возрасте 11 — 12 дней вирусами группы оспы), в аллантоисную и амниотическую полости (10—11-дневными миксовирусами), желточный мешок (в возрасте 5—6 дней возбудителями пситтакозаорнитоза и др.). Инокуляцию материала эмбрионам в мозг и внутривенно (в сосуды оболочек) производят редко. При любом способе заражения эмбрионы могут быть травмированы, поэтому погибших в первые 24—48 час. из учета исключают.

Для изучения действия на вирусы хим. веществ весьма удобны деэмбрионированные яйца, в которых удален эмбрион, но сохранена хорионаллантоисная оболочка. Внутрь помещают вирус и изучаемое вещество в 20 мл изотонического раствора хлорида натрия. Отверстие в скорлупе закрывают колпачком с трубочкой, через к-рую можно брать пробы для анализа.

При оценке опытов на животных и эмбрионах птиц следует иметь в виду возможность провокации у них латентных инфекций или выделения находящегося в латентном состоянии вируса.

Исключительно широко для выделения и накопления вирусов применяют культуры клеток и тканей (см.). Этими методами можно культивировать большинство известных вирусов (см. Культивирование вирусов). Некоторые из них интенсивно накапливаются уже при первичном заражении культур, для адаптации других требуется несколько пассажей. Размножение большинства вирусов в клеточных культурах сопровождается развитием цитопатического эффекта. По его характеру в известной степени можно судить о принадлежности вирусов к тому или иному роду: пикорнавирусы вызывают округление и сморщивание клеток, аденовирусы — образование округлившимися клетками скоплений в виде виноградных гроздьев, миксовирусы и герпетические вирусы — формирование многоядерных синцитиев. Ряд вирусов культивировать вне организма не удается.

Размножение некоторых вирусов (оспенная группа, миксо- и арбовирусы) можно обнаружить с помощью реакции гемадсорбции, поскольку пораженные клетки приобретают способность адсорбировать эритроциты. Соответствующие эритроциты (человека, обезьяны, морской свинки, курицы) в концентрации 0,4—0,5% помещают на монослой при t° 4° или при комнатной температуре на 20— 30 мин. Эритроциты адсорбируются диффузно по всей культуре (напр., парагриппозными вирусами) или формируют островки (вирусы гриппа, паротита).

О размножении вируса иногда судят путем исследования культуральной жидкости на животных (клещевой энцефалит) или в РСК. Наличие вируса, не обладающего цитопатической активностью, иногда определяют по его способности интерферировать с цитопатогенным вирусом. Так, в культурах клеток эмбрионов кур, инфицированных вирусами лейкозов птиц, подавляется размножение вируса саркомы Рауса. Для обнаружения нецитопатогенных штаммов вирусов диареи крупного рогатого скота и холеры свиней предложен метод END (exaltation of Newcastle disease virus) — суперинфицирование культур вирусом болезни Ньюкасла. При совместном действии обоих вирусов наступает разрушение клеток.

При появлении цитопатических изменений или других признаков размножения вируса культуральную жидкость используют для идентификации вируса или пассажа. Ряд вирусов остается связанным с клетками даже при дегенерации культуры (аденовирусы, вирусы группы оспы), вследствие чего производят замораживание и оттаивание культур перед сбором жидкости. Некоторые герпетические вирусы, напр, вирус болезни Марека у кур, необходимо пересевать вместе с неповрежденными клетками.

Для изучения респираторных корона-вирусов человека и некоторых других используют метод тканевых культур, т. е. заражение культивируемых in vitro тканевых фрагментов. Чаще всего используют ткань трахеи кролика. Размножающийся вирус поражает клетки эндотелия слизистой оболочки, что определяют по прекращению движения ресничек.

Следует учитывать возможность присутствия в культурах тканей и клеток посторонних вирусов. Они могут быть внесены с клетками, если последние взяты из инфицированного организма, попасть из трипсина или сыворотки, использованной для культивирования клеток.

Помимо посева биопсийного или секционного материала на уже выращенные культуры, применяют непосредственное культивирование клеток исследуемого органа после его трипсинизации, что нередко более эффективно в отношении выделения вируса (напр., обнаружение аденовирусов в миндалинах). Используют также методику смешанных культур, когда клетки исследуемого органа выращивают вместе с какими-либо чувствительными к данному вирусу клетками (напр., посев клеток мозга больных подострым склерозирующим панэнцефалитом вместе с клетками почек обезьян или Hela-клетками для выделения вируса кори). Метод смешанных культур является зачастую единственным способом выделения вируса из индуцированных им у животных опухолей, которые не продуцируют активного вируса, однако содержат вирусный геном.

Рис. 2. Бляшки вируса полиомиелита на культуре клеток почки обезьяны.
Рис. 2. Бляшки вируса полиомиелита на культуре клеток почки обезьяны.

Однослойные клеточные культуры дают возможность получить колонии вируса — бляшки (рис. 2). Как правило, бляшки формируют вирусы, обладающие цитопатической активностью. В то же время этот метод позволяет обнаруживать некоторые нецитопатогенные вирусы (напр., ряд штаммов вируса диареи крупного рогатого скота). Для получения бляшек вирус вносят на клеточный монослой в чашках или плоских флаконах. Множественность заражения, т. е. число вирусных частиц на одну клетку, должна быть небольшой, чтобы образовавшиеся бляшки не сливались. После 30—60 мин. адсорбции наслаивают питательную среду с 1,35 — 1,5% агара и нейтральным красным в конечном разведении 1 : 40 000. Культуры в чашках Петри инкубируют в атмосфере с 5—10% углекислоты, а герметически закрытые флаконы — в обычном термостате. Через несколько дней среди прижизненно окрашенных клеток начинают выделяться неокрашенные фокусы из дегенерированных клеток.

Можно на клетки помещать агар без нейтрального красного, а через несколько дней нанести второй слой агара с красителем; бляшки становятся видимыми через несколько часов. Агар иногда содержит сульфаты полисахаридов, которые являются ингибиторами роста вирусов; для их нейтрализации в среду добавляют протамин-сульфат (60 мг на 100 мл). Для получения бляшек ряда вирусов можно использовать в качестве покрытия метилцеллюлозу и другие вещества. Некоторые вирусы (оспы, кори) формируют бляшки и без агарового покрытия. Метод бляшек позволяет провести клональный анализ вирусных штаммов. Для выделения генетически однородных клонов извлекают одну бляшку, к-рую используют для следующего заражения. Обычно клонирование проводят на протяжении трех пассажей.

Метод бляшек пригоден также для определения в зараженной культуре количества клеток, продуцирующих вирус (т. е. число инфекционных центров). Для этого клетки суспендируют, помещают на однослойную культуру чувствительных к вирусу индикаторных клеток и заливают агаром. Вокруг зараженных клеток формируются бляшки.

Для диагностики вирусных инфекций и изучения антигенной структуры вирусов применяется реакция преципитации в геле. Чаще всего с этой целью используют агар. Антигены и специфические антитела, помещенные в агаровый гель на определенном расстоянии, диффундируют и образуют при встрече преципитат в виде белых полос. 0,8—1% агар в изотоническом растворе хлорида натрия или фосфатном буфере помещают в капилляры или наносят слоем на предметные стекла. Антигены предпочтительно иметь очищенные и концентрированные. Ингредиенты реакции вносят на агар в противоположные концы капилляра или в лунки, сделанные в слое агара на стеклах на расстоянии 5—6 мм. Инкубация продолжается 4—20 час.

Значительное число В. и. выполняют с помощью световой и электронной микроскопии. Наиболее крупные вирусы (напр., оспы) после соответствующей обработки (серебрение, окраска викторияблау и др.) могут быть выявлены при обычной световой микроскопии. Этот метод применяют при диагностике оспы путем обследования материала из пустул. Характерным для некоторых инфекций является формирование в клетках телец — включений. Так, в ядрах появляются включения при герпетической и аденовирусной инфекции, в цитоплазме — при оспе (тельца Гуарниери) и бешенстве (тельца Бабеша— Негри). Обнаружение включений имеет значение для диагностики бешенства, оспы, цитомегалии, подострого склерозирующее панэнцефалита и др.

Микроскопию в темном поле (см. Темнопольная микроскопия) и фазово-контрастную микроскопию (см.) используют гл. обр. для изучения динамики изменений в пораженных вирусом клетках. Более широко применяют люминесцентную микроскопию (см.).

Исследуют мазки, отпечатки и выращенные на стеклах однослойные клеточные культуры. Препараты (нативные или фиксированные) чаще всего окрашивают акридином оранжевым. Метод позволяет выявлять крупные вирусы и скопления вирусных компонентов. Образования, содержащие ДНК, светятся ярко-зеленым светом, а содержащие РНК — кирпично-красным. Еще чаще при В. и. производят обработку зараженных клеток флюоресцирующими антителами, что позволяет выявить скопления вирусного антигена. При прямом методе используют иммунный гамма-глобулин, меченный флюоресцентным красителем, напр, флюоресцеин-изотиоцианатом. При непрямом методе препарат обрабатывают обычной иммунной сывороткой какого-либо животного, а затем мечеными антителами против гамма-глобулина этого животного. Препараты просматривают в ультрафиолетовом свете, вирусный антиген обнаруживают по светло-зеленому свечению (см. Иммунофлюоресценция). Метод мазков из носоглотки позволяет проводить раннюю диагностику респираторных вирусных инфекций — гриппозной, парагриппозной, рино- и аденовирусной, респираторно-синцитиальной.

Электронная микроскопия (см.) позволяет изучать размеры и структуру вирусных частиц, а также тонкие изменения, вызываемые ими в клетках. Исследуют вирусную взвесь или ультратонкие срезы зараженных клеток. Некоторые вирусы (напр., ряд онкорнавирусов человека и животных) удается обнаружить в тканях только этим методом.

В. и., цель которых — определить количество (титр) вируса или вирусных антител, очень разнообразны.

Под электронным микроскопом можно подсчитать число вирусных частиц во взвеси, если она достаточно очищена. Вирус смешивают с полистирольным латексом, число частиц к-рого известно. Смесь распыляют на сетке, подсчитывают число частиц в отдельных каплях. По соотношению числа частиц латекса и вирусов выявляют число вирионов в данном объеме. Этот метод не дает представления об инфекционной активности вируса, поскольку вирусная взвесь обычно содержит значительное число неинфекционных частиц.

Наиболее точно определить число инфекционных единиц в материале позволяет метод бляшек. Однослойные клеточные культуры заражают небольшой дозой вируса. Титр выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Аналогичным образом можно определить титр некоторых онкогенных вирусов по очагам трансформации, а также тех возбудителей, которые образуют оспины на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов (напр., вируса оспы).

Менее точным является определение титра вируса методом конечных разведений. Последовательно возрастающие разведения (обычно десятикратные) вводят чувствительным животным, в куриные эмбрионы или клеточные культуры. Учитывая результат каждого введения как положительный или отрицательный, определяют наименьшую дозу вируса, способную вызвать определенный эффект (заболевание или гибель животного, появление цитопатических изменений в культуре и т. п.). Практически эту дозу определить трудно, поэтому вычисляют дозу, дающую 50% эффект (ED50). Ее определяют в зависимости от свойств вируса и метода титрования по числу погибших животных (LD50), числу заболевших (ID50), количеству эмбрионов, у которых появились вирусные Гемагглютинины или комплементсвязывающие антигены, по числу клеточных культур, где были выявлены цитопатические изменения или гемадсорбирующая активность. Титр выражают числом ED50 в определенном объеме материала.

Из существующих способов вычисления ED50 наиболее употребительным является метод Рида — Мюнча, основанный на принципе кумуляции. В его основе лежит допущение, что каждый испытуемый объект (мышь, эмбрион), ответивший положительно на введение данного разведения, ответил бы положительной реакцией на введение более концентрированного вируса. И, наоборот, если данное разведение вызвало отрицательную реакцию, то при введении большего разведения тоже будет отрицательная реакция. Интервалы между разведениями при этом методе должны быть одинаковыми, каждым разведением заражают не менее 4 животных (культур). Далее производят интерполирование между дозами, которые обусловили эффект, наиболее близкий к 50%. Расчет производят по формуле:

Virus issled0.png

где В — наименьшая доза, вызвавшая эффект больше 50%, b — эффект дозы В в процентах, а — эффект наибольшей дозы, вызвавшей эффект меньше 50%, в процентах, d — интервал между логарифмами двух соседних доз.

Вирусы с выраженной цитопатической активностью (напр., вирус полиомиелита) можно титровать методом цветной пробы. Она основана на том, что в процессе роста клеток понижается pH среды, а в зараженных культурах, где клетки дегенерируют, изменения pH среды не происходит. Для выявления этих изменений в среду добавляют индикатор — феноловый красный, имеющий при pH выше 7 красный цвет, при pH 7 — оранжевый и при pH ниже 7 — желтый. В питательную среду, имеющую pH 7,3—7,4, вносят феноловый красный в конечной концентрации 1 : 40 000. Определяют минимальную дозу клеток, меняющую цвет среды с красного на желтый (обычно это около 25 000 в 0,25 мл). Далее готовят 10-кратные разведения вируса, каждое из которых наливают в 4—6 пробирок, куда добавляют клеточную взвесь. Пробирки закрывают резиновыми пробками или заливают 0,6—0,8 мл вазелинового масла. Результаты учитывают после выдерживания в течение 5—7 дней при t° 37°. За титр вируса принимают его разведение, препятствующее сдвигу pH в кислую сторону в 50% пробирок.

Способность иммунных сывороток нейтрализовать инфекционную активность вирусов определяют с помощью реакции нейтрализации. Методы титрования сывороток предопределяются способами титрования соответствующих вирусов. Все они основаны на приготовлении смесей вируса с сывороткой, которые затем испытывают на наличие ненейтрализованного вируса. Реакцию ставят в двух вариантах. По одному из них иммунную и нормальную сыворотку в одном разведении (напр., 1 : 10) смешивают с возрастающими 10-кратными разведениями вируса в равном объеме и определяют титр вируса в присутствии той и другой сыворотки. Частное от деления ED50 вируса в присутствии нормальной сыворотки на его ED50 в присутствии иммунной будет индексом нейтрализации данного разведения иммунной сыворотки. Интерполировать этот результат на другие разведения сыворотки нельзя (напр., активность неразведенной сыворотки будет выше вычисленной). По другому варианту реакции постоянную дозу вируса (обычно около 100 ED50) соединяют с рядом 2-кратных разведений испытуемой сыворотки. Титром сыворотки будет разведение, с к-рым вирус вызвал 50% эффект.

В зависимости от метода титрования вируса реакцию нейтрализации проводят на лабораторных животных, куриных эмбрионах (по их гибели или накоплению гемагглютининов), на клеточных культурах (по появлению цитопатических изменений, цветной пробе и т. п.). Если вирус образует оспины на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов, определяют наибольшее разведение сыворотки, уменьшающее число оспин на 50 и более процентов. Аналогичным образом титруют сыворотки по редукции числа вирусных бляшек на однослойных клеточных культурах.

Титрование вирусов по РГА и антител по РТГА основано на способности ряда вирусов (миксовирусы, некоторые представители рода поксвирусов, аденовирусов, пикорнавирусов и тогавирусов) склеивать эритроциты. Вирус титруют в двукратных разведениях с равным объемом 0,5—1% взвеси эритроцитов. За титр (1 АЕ — агглютинирующая единица) принимают наибольшее его разведение, вызвавшее гемагглютинацию (см.). Гемагглютинирующий титр вируса не является показателем его инфекционной активности, поскольку гемагглютинации) могут вызывать неинфекционные «неполные» частицы, инактивированный вирус и отделимый от некоторых вирусов Гемагглютинирующий антиген. Сыворотки по РТГА титруют в двукратных разведениях с 2—4 АЕ вируса; титром считают наибольшее разведение, полностью тормозящее гемагглютинации).

Некоторые вирусы адсорбируются на эритроцитах, но не вызывают их агглютинации. Для их выявления можно использовать реакцию непрямой гемагглютинации. Она основана на агглютинации «нагруженных» вирусом эритроцитов специфической по отношению к этому вирусу сывороткой. Этот метод используют в основном для титрования сывороток.

Реакция связывания комплемента (см.) пригодна для титрования как вирусов (точнее комплементсвязывающих вирусных антигенов), так и антител. Принципиально РСК с вирусами не отличается от таковой с бактериальными и прочими антигенами. Различия имеются лишь в способе приготовления антигенов. В качестве вирусных антигенов могут служить кровь, носоглоточные смывы, моча, фекалии больных, взвеси инфицированных органов, отдельные части зараженных куриных эмбрионов и выращенный в клеточных культурах вирус. Наиболее пригодны культуральные антигены. Взвеси зараженных органов перед использованием многократно замораживают и оттаивают, соединяют с равным объемом эфира или хлороформа, встряхивают 1—2 часа, после чего выдерживают 18—20 час. при t° 4°, вновь замораживают, оттаивают и осветляют центрифугированием. Для получения сывороток не следует иммунизировать животных вирусом, культивированным в том же субстрате, что и антиген для реакции. В зависимости от целей титрования соединяют двукратные разведения антигена с определенной дозой сыворотки или, наоборот, двукратные разведения сыворотки с одной дозой антигена. Контакт антигена, сыворотки и комплемента осуществляют в течение 1 часа при t° 37° или 18 час. при t° 4—6°. После добавления гемосистемы материал инкубируют 30 мин. при t° 37°. Оценку результатов производят по общим правилам.

Существуют методы титрования вирусов и антител, основанные на индикации вируса в зараженных клетках культуры флюоресцирующими антителами, а также ряд других, которые применяют довольно редко.

Токсическое действие, присущее нек-рым вирусам, выявляют путем введения животным больших доз необычным путем, при к-ром вирус не проходит полного цикла репродукции. Так, напр., вирус гриппа вводят мышам в мозг или внутривенно. О его токсическом действии судят по гибели животных в течение первых суток.

Антигенную активность вируса (или вакцины) устанавливают путем иммунизации людей или животных с последующим определением титра антител в их сыворотке. Иммуногенную активность вакцины, т. е. способность вызывать устойчивость к инфекции, определяют путем иммунизации чувствительных к данному вирусу животных. Затем иммунизированных животных и контрольных неиммунизированных заражают рядом разведений вируса, определяя его ED50 для обеих групп. Разница в полученных показателях характеризует иммуногенность испытуемого препарата. Если вирус не обладает патогенностью для животных, иммуногенность соответствующей вакцины можно определить лишь в эпидемиол. опыте.

Для изучения ряда свойств вирусов (размеров, структуры, хим. состава и т. п.) необходимо иметь очищенный материал с высоким титром. Чаще всего используют вирус, выращенный в клеточных культурах или в виде аллантоисной жидкости инфицированных куриных эмбрионов. Очистку обычно начинают с дифференциального центрифугирования: сначала при 15—20 тыс. g (g— ускорение силы тяжести) освобождают материал от клеточного детрита, а при 50—100 тыс. g — осаждают сам вирус. Для освобождения от крупных частиц применяют также фильтрацию через асбестовые прокладки (типа Зейтца), стеклянные и целлюлозные мембранные фильтры (типа миллипоровых). Фрагменты, которые меньше вирусов, можно удалить фильтрацией материала через сефадекс-гели, задерживающие в зависимости от величины пор частицы определенного размера. Для выделения и концентрации вируса из больших объемов применяют высаливание с помощью сульфатов аммония и натрия, осаждение спиртом, гидроокисью алюминия или полиэтилен-гликолем. Для освобождения от балластных белков используют также их переваривание протеолитическими ферментами. Миксовирусы можно очистить и сконцентрировать путем адсорбции на эритроцитах при низкой температуре с элюцией при более высокой.

Дальнейшую очистку и концентрацию вируса производят тем или иным методом фракционирования. Эти методы используют также для разделения мутантов вируса и отдельных вирусных компонентов. При смешении вируса с фазовой системой, образованной водными растворами двух полимеров, он переходит в одну из фаз в зависимости от своего размера, ионного состава среды, pH и др. Для очистки крупных вирусов обычно используют систему декстрансульфат — метилцеллюлоза, мелких — декстрансульфат с полиэтиленгликолем. Полимеры, оставшиеся после разделения фаз, часто удаляются в процессе дальнейшей очистки вируса. Можно также удалить декстрансульфат прибавлением хлорида калия, метилцеллюлозу с помощью сульфата аммония, полиэтиленгликоль хлороформом и другими методами.

Очистка вирусов с помощью хроматографии на колонке основана на их способности адсорбироваться на ряде веществ, а при изменении pH или концентрации солей элюировать с них (см. Хроматография). Для адсорбции применяют гели фосфата кальция, ионообменники на целлюлозной основе (чаще всего анионообменники, напр, диэтиламиноэтилцеллюлозу), ионообменные смолы. Элюцию вируса с фосфата кальция осуществляют фосфатными буферными растворами возрастающей концентрации, а с ионообменников на целлюлозной основе — растворами хлорида натрия.

Высокоочищенные взвеси получают центрифугированием в столбе жидкости с плотностью, распределенной в непрерывном градиенте. Вирусные частицы собираются на том уровне, где плотность среды равна их плавучей плотности. Зональное центрифугирование в градиенте сахарозы позволяет разделить частицы с различной массой. Материал наносят на градиент, созданный путем наслаивания соответствующих растворов сахарозы. По окончании центрифугирования собирают фракции, прокалывая дно пробирки. При равновесном или изопикническом центрифугировании вирусные частицы суспендируют в растворе хлорида цезия, сульфата цезия или хлорида рубидия. После длительного центрифугирования создается устойчивый непрерывный градиент плотности раствора. По месту локализации вирусных частиц можно определить их плотность. Следует отметить, что полученные значения плотности и массы вирусных частиц в известной степени зависят от использованной при центрифугировании среды.

При В. и. широко используют вирусы, меченные различными радиоактивными изотопами. Чаще всего применяют углерод 14C, тритий 3H, фосфор 32P, серу 35S, йод 131I. Легче всего метить вирус при его культивировании в клеточных культурах. Радиоактивность определяют с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков или методом авторадиографии (см.).

Хим. состав вирусов исследуют общепринятыми хим. методами. Нуклеиновую к-ту обычно получают фенольной экстракцией, реже применяют анионные детергенты — додецил- или лаурилсульфат натрия.

Для идентификации вирусов (см.) в первую очередь следует установить их родовую принадлежность. Для этого необходимо определить размеры и структуру вирусных частиц, вид входящей в их состав нуклеиновой к-ты, наличие липоидной оболочки. Вид нуклеиновой к-ты чаще всего определяют косвенными методами, напр, используя способность бромдезоксиуридина подавлять размножение ДНК-содержащих вирусов. Наличие липоидной оболочки у вируса устанавливают по его чувствительности к действию эфира и хлороформа (имеющие оболочку вирусы инактивируются). Дальнейшую идентификацию проводят с набором иммунных сывороток к известным вирусам, используя различные реакции — нейтрализации, РСК, РТГА и др. Реже производят иммунизацию животных известным вирусом с дальнейшим их заражением неизвестным или наоборот.


Библиография:

Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974, библиогр.;

Лурия G. Е. и Дарнелл Дж. Е. Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970, библиогр.; Методы вирусологии и молекулярной биологии, пер. с англ., М., 1972; Пшеничнов В. А., Семенов Б.Ф. и Зезеров Е. Г. Стандартизация методов вирусологических исследований, М., 1974, библиогр.; Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней, под ред. П. Ф. Здродовского и М. И. Соколова, М., 1965; Соколов М. И., Синицкий А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.



Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание