ХРОМАТОГРАФИЯ

ХРОМАТОГРАФИЯ, хроматографический анализ— физико-химический метод разделения жидких или газообразных смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна (стационарна), другая — подвижна и непрерывно протекает через неподвижную фазу. Хроматография является одним из наиболее широко применяемых аналитических методов в биохимии и медицинской химии, токсикологии, фармации. Метод хроматографического разделения незаменим при анализе фармацевтических препаратов, определении устойчивости лекарственных средств к различным воздействиям, анализе смесей и веществ природного происхождения, пригоден для разделения полимеров по мол. весу (массе), составу и микроструктуре (в том числе по стереоструктуре). Хроматография широко используется в клинико-диагностических лабораториях.

Развитие биоорганической химии, физической химии полимеров и молекулярной биологии дало хроматографии новый объект для исследования — высокомолекулярные соединения (см.). Возникла необходимость в разделении биополимеров, нуклеиновых кислот (см.), белков (см.), а также вирусов (см.), фагов (см. Бактериофаг), рибосом (см.) и др. Большую роль в этом играют методы фракционирования биополимеров на ионообменных целлюлозах и основанная на биоспецифической сорбции аффинная хроматография. Существенное развитие получают методы анализа веществ и особенно полимеров, в которых различные хроматографические методы комбинируются друг с другом, а также с вискозиметрическими (см. Вязкость), седиментационными (см. Седиментация) и спектроскопическими (см. Спектроскопия) методами анализа.

В отличие от других методов разделения, также основанных на распределении веществ между фазами (например, экстрагирования), хроматография является динамическим методом, так как разделение происходит в потоке подвижной фазы. Отличительной особенностью хроматографических методов является их универсальность, то есть возможность использования их для разделения жидких и газообразных органических и неорганических соединений различного состава в широком интервале их концентраций. В роли подвижной фазы выступает чаще всего газ или жидкость, в качестве стационарной (неподвижной) — жидкость или твердое вещество. Разделение компонентов происходит вследствие различия в скоростях их адсорбции (см.), растворения или реакции с подвижной и неподвижной фазами.

Термин «хроматография» был введен М. С. Цветом в 1901 —1903 годах для обозначения процесса разделения растительных пигментов (см.) в ходе пропускания содержащих их экстрактов через стеклянную колонку с карбонатом кальция, а само распределение в колонке по-разному окрашенных компонентов было названо им хроматограммой. М. С. Цвет предложил основные варианты метода и разработал соответствующую аппаратуру. Опыты М. С. Цвета были воспроизведены лишь в 1941 году. После этого хроматография начала совершенствоваться быстрыми темпами на фоне развития теории адсорбции и ионного обмена (см. Ионообменные реакции) и успехов в синтезе и применении новых эффективных неорганических и органических сорбентов, в том числе ионообменных смол (см. Иониты). Одновременно совершенствовалась техника хроматографического анализа и разрабатывались новые принципы сорбционного разделения веществ.

Как было сказано выше, хроматографическая система состоит из подвижной и неподвижной фаз. Компоненты разделяемой смеси перемещаются через пористую стационарную фазу под влиянием движущейся жидкости или газа, составляющих подвижную фазу. В некоторых случаях стационарной фазой служит тонко измельченное или гранулированное твердое вещество, помещенное в узкую стеклянную или металлическую трубку (колонку), подвижную фазу иногда пропускают через колонку под давлением. В других методах стационарной фазой может быть измельченное сорбирующее твердое вещество, нанесенное тонким слоем на стеклянную пластинку, или специальная хроматографическая бумага. Передвижение подвижной фазы через твердое вещество обусловлено капиллярными или гравитационными силами. Как правило, твердое вещество не принимает участия в разделении, а лишь удерживает стационарную жидкую фазу. Для хроматографического разделения смесей используют также пленки из пористых материалов и специальные сорта бумаги. Стационарной фазой может служить неподвижная жидкость, не смешивающаяся с подвижной фазой.

Благодаря тенденции к достижению термодинамического равновесия (см. Термодинамика) между фазами происходит обмен молекулами разделяемых веществ, осуществляемый направленными диффузионными потоками (см. Диффузия) из одной фазы в другую и протекающий на фоне случайных перемещений молекул в каждой из фаз. В неподвижной фазе это перемещение носит исключительно тепловой характер (см. Молекула), а в подвижной — связано также с гидро(аэро)динамическими условиями (см. Гидродинамика) течения раствора (см. Растворы) или газовой смеси (см. Газы).

При движении вдоль хроматографической системы молекулы разделяемых веществ часть времени находятся в неподвижной фазе (их средняя скорость в направлении движения равна нулю), а часть времени — в подвижной, где они перемещаются со скоростью, равной скорости движения фазы. Переход молекул из подвижной фазы в неподвижную называют сорбцией, а обратный — десорбцией. При наличии адсорбционного взаимодействия молекулы адсорбируются на поверхности сорбента (в адсорбционной хроматографии); в отсутствие адсорбционного взаимодействия сорбция сводится к пребыванию молекул в неподвижной фазе. Если хроматографическое разделение ведется с использованием пористого сорбента, то молекулы задерживаются в его поровом пространстве, как, например, в гель-фильтрационной хроматографии (см. Г ель-фильтрация).

Все типы хроматографического разделения основаны на разной степени распределения растворенных веществ между подвижной и стационарной фазами. Установившееся равновесие количественно описывается константой, зависящей от температуры и называемой коэффициентом распределения. Коэффициент распределения равен отношению концентрации анализируемого вещества в неподвижной фазе к его концентрации в подвижной фазе. В зависимости от вида хроматографии его называют коэффициентом распределения (в газожидкостной, или распределительной, и ионообменной хроматографии), коэффициентом адсорбции (в адсорбционной хроматографии) и коэффициентом проницаемости (в молекулярно-ситовой хроматографии). Этот параметр определяет скорость перемещения веществ по слою сорбента. Скорость перемещения веществ при хроматографическом разделении является в данных условиях величиной постоянной и характеристической для каждого вещества. Ее оценивают по величине RF, которая представляет собой отношение расстояния от стартовой линии хроматограммы до центра зоны, занимаемой данным веществом в любой момент времени, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя.

В зависимости от химической природы молекул, определяющей взаимодействие с сорбентом, или от соотношения их размеров с размерами пор сорбента молекулы хроматографируемых веществ проводят разное время в фазах хроматографической системы. При этом более сорбируемые молекулы проводят в неподвижной фазе больше времени, чем менее сорбируемые. В результате они медленнее движутся вдоль хроматографической системы, чем и объясняется разделение смеси веществ на составляющие их компоненты в процессе хроматографирования. Одновременно с этим происходит размывание зоны каждого компонента смеси. Оно является следствием теплового движения молекул и случайного характера (стохастичности) хроматографического процесса. Если скорость размывания зон компонентов смеси меньше разности скоростей их перемещения вдоль хроматографической системы, то эти компоненты можно выделить из смеси хроматографическим путем.

В зависимости от целей разделения различают аналитическую хроматографию, используемую для анализа состава сложных смесей, препаративную хроматографию — для получения веществ, находящихся в смеси или в чистом виде, и хроматографию, применяемую с целью физико-химических исследований.

Наиболее важными показателями, отражающими физико-химическую сущность и особенности хроматографического анализа, являются следующие: 1) агрегатное состояние разделяемых веществ — газ (пар) или жидкость; 2) природа сорбента — твердое вещество или жидкость; 3) характер взаимодействия между сорбентом и разделяемыми веществами — распределение молекул или ионов между двумя фазами, образование координационных соединений в фазе или на поверхности сорбента, протекание окислительно-восстановительных реакций при контакте разделяемых веществ с сорбентом; 4) техника выполнения анализа — в колонке, капилляре, на бумаге, в тонком слое сорбента.

Разнообразие хроматографических методов не позволяет классифицировать их по какому-либо одному критерию. Один и тот же метод хроматографического анализа может применяться в различных вариантах. Так, осадочную хроматограмму можно получить в колонке с сорбентом, на бумаге или в гелях. Определенный принцип разделения (например, распределение молекул между фазами) часто лежит в основе различных методов хроматографического анализа. В то же время, например, в тонкослойной хроматографии, возможен практически любой принцип разделения — сорбционный, распределительный, ионообменный и др. На практике применяют разные методы и варианты хроматографии. Она может различаться по форме сорбционного слоя, способу перемещения анализируемой смеси, агрегатному состоянию подвижной и неподвижной фаз и др. Например, в зависимости от формы слоя сорбента различают плоскостную и колоночную хроматографию.

В плоскостной хроматографии сорбент в виде тонкого однородного слоя распределяется на пластинке (хроматография в тонком слое, тонкослойная хроматография, TGX) или же сорбционным слоем служит специальная бумага (хроматография на бумаге). По сравнению с хроматографией на бумаге ТСХ получила более широкое распространение благодаря своей простоте и возможности разделения небольших количеств многокомпонентных смесей. В качестве сорбента для ТСХ в большинстве случаев применяют силикагель, неподвижной фазой обычно служит вода, а подвижной — различные растворители. ТСХ отличается большой быстротой разделения веществ, устойчивостью к нагреванию и некоторым реагентам, разрушающим бумагу, а также высокой чувствительностью. Благодаря этим качествам хроматография в тонком слое стала одним из наиболее распространенных аналитических методов, применяемых в фармации, токсикологии и биохимии. Классическая методика плоскостной хроматографии состоит из следующих операций: 1) нанесение анализируемой пробы на слой сорбента; 2) разделение компонентов смеси на отдельные зоны в потоке подвижной фазы; 3) обнаружение зон на слое сорбента (часто с помощью реагента, образующего с разделенными веществами окрашенные соединения); 4) количественная оценка полученного разделения, в т. ч. определение содержания вещества в зонах на хроматограмме.

В колоночной хроматографии сорбент помещают в специальные трубки — колонки. Различают набивные (насадочные) и капиллярные колонки. В первых весь объем трубки заполнен сорбентом. Во вторых — сорбент наносят только на поверхность внутренних стенок колонки. По способу перемещения разделяемой смеси вдоль слоя сорбента различают следующие методы колоночной хроматографии: фронтальный, вытеснительный, проявительный (элюентный). Если проба служит подвижной фазой, то разделение называют фронтальным. Вытеснительная колоночная хроматография основана на использовании элементов, имеющих большее сродство к неподвижной фазе, чем к растворенному веществу. В проявительной колоночной хроматографии подвижная фаза выполняет только транспортную функцию по отношению к растворенному веществу.

В наиболее простом варианте колоночной хроматографии — фронтальном анализе пробу непрерывно подают в колонку. При этом на сорбенте образуются зоны с последовательно увеличивающимся числом компонентов. Наименее сорбируемое вещество продвигается с большей скоростью и образует первую зону или фронт. Вторая зона содержит смесь второго вещества с первым, а третья зона представляет собой смесь уже трех веществ: третьего, второго и первого и т. д. Во фронтальном анализе только один слабосорбирующийся компонент получают в чистом виде. Этот метод для целей аналитического разделения используют мало. Значительно чаще его применяют для концентрирования легких или тяжелых компонентов смеси.

В вытеснительной колоночной хроматографии пробу вносят в колонку однократно и затем компоненты смеси перемещаются по слою сорбента за счет их вытеснения из неподвижной фазы элюентом, который сорбируется активнее любого из компонентов смеси. При этом подвижная фаза вытесняет наиболее сильно сорбирующийся компонент, который, в свою очередь, вытесняет следующий, менее сорбирующийся компонент, и т. д. В результате образуются зоны, соответствующие компонентам смеси. Каждый из компонентов можно выделить в чистом виде. Однако это выделение не может быть количественным из-за перекрывания и наложения зон, которые только в идеальном случае разделяются полностью. Этот метод, так же как и метод фронтальной хроматографии, мало используется в аналитической практике, иногда его применяют для препаративных целей.

При проявительной (элюентной) колоночной хроматографии подвижная фаза сорбируется значительно меньше, чем любой из компонентов разделяемой смеси, поэтому она служит только для перемещения растворенного вещества вдоль хроматографической системы. Анализируемую смесь вводят периодически. Разделение компонентов определяемой смеси в этом случае происходит благодаря их разному сродству к неподвижной фазе и, следовательно, благодаря разным скоростям их перемещения вдоль системы. При выборе оптимальных условий разделения можно полностью разделить все компоненты даже наиболее сложных смесей. Благодаря высокой эффективности разделения этот метод получил широкое распространение и практически полностью вытеснил другие варианты хроматографии.

Если регистрировать изменение концентрации растворенного вещества на выходе из хроматографической системы и изобразить это изменение графически как функцию времени, на графике получится серия симметричных пиков. Такие графики, также называемые хроматограммами, используют как в качественном, так и в количественном анализе: положение пика можно использовать для идентификации компонента пробы, а площадь на кривой, занимаемая этим пиком, характеризует концентрацию вещества.

По типу подвижной фазы хроматография делится на газовую и жидкостную. Газовая хроматография (газоадсорбционная, газожидкостная) применяется для разделения летучих веществ, жидкостная хроматография — для анализа и фракционирования термолабильных и нелетучих веществ.

В газовой хроматографии газ-носитель (обычно водород, гелий или диоксид углерода) поступает в колонку газохроматографа. На пути газа с помощью шприца-пипетки или стеклянной ампулы вводят определенное количество исследуемого вещества (смеси). Компоненты исследуемой смеси поглощаются адсорбентом в соответствии с их сорбционными свойствами. При дальнейшем пропускании га за-носителя поглощенные вещества начинают десорбироваться и последовательно выходить из колонки. В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы различают два вида газовой хроматографии: газоадсорбционную, в этом случае колонка заполнена твердым веществом — адсорбентом, и газожидкостную, при к-рой колонка заполнена зернами твердого вещества-носителя с пленкой жидкости.

В жидкостной хроматографии в качестве подвижной фазы используют жидкость. В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы в жидкостно-адсорбционной и жидкостно-жидкостной хроматографии также могут быть варианты.

По типу сорбентов, используемых в качестве неподвижной фазы, и по характеру взаимодействий, обусловливающих распределение компонентов между подвижной и неподвижной фазами, можно выделить следующие основные типы хроматографии: адсорбционная; распределительная; осадочная; ионообменная; аффинная; молекулярно-ситовая, или гель-фильтрационная; окислительно -восстановительная.

Адсорбционная хроматография основана на различной адсорбируемости компонентов смесей, связанной с особенностями их строения и состава. Разделение возникает вследствие ничтожной разницы в адсорбируемости или в кинетике сорбции и десорбции анализируемых разделяемых веществ. При движении разделяемой смеси в жидкой или газообразной фазе сквозь неподвижный слой сорбента, состоящего из дискретных элементов (гранул или волокон, обладающих большой суммарной поверхностью), элементарные акты сорбции и десорбции многократно повторяются. Многократное повторение этих процессов является характерной особенностью хроматографического метода, оно создает необходимые условия для разделения компонентов сложных смесей с весьма близкими свойствами. Сорбционная способность зависит как от химической природы того или иного компонента смеси, так и от химического и физического состава самого адсорбента. В качестве адсорбентов применяют окись алюминия, активированный уголь, силикагель, о-оксихинолин и другие вещества. Эффективность хроматографического метода определяется различной сорбционной способностью веществ и скоростью продвижения зон при промывании колонки растворителем. В практике часто используют последовательное вымывание вещества растворителями с постепенно увеличивающейся десорбционной способностью. В этом случае компоненты смеси последовательно десорбируются и вымываются из системы.

Распределительная хроматография основана на различной растворимости разделяемых компонентов в двух несмешивающихся растворителях, один из которых нанесен на поверхность макропористого твердого носителя, индифферентного к хроматографируемым веществам, и образует стационарную фазу. После насыщения носителя неподвижным растворителем через систему пропускают второй растворитель с растворенной в нем анализируемой смесью и затем тем же растворителем промывают колонку. При этом компоненты смеси движутся с различными скоростями, обратно пропорциональными их коэффициентам распределения. Методика колоночного распределительного хроматографического разделения почти не отличается от методики адсорбционного разделения, описанной выше: промывая (элюируя) колонку растворителем, собирают отдельные порции элюата, который затем анализируется различными методами (см. Элюция). Распределительная хроматография наряду с адсорбционной газовой хроматографией используется и при анализе газов. В этом случае на адсорбент в качестве неподвижной фазы наносят высококипящую жидкость; разделение газов происходит в результате их различной растворимости в этой жидкостной пленке.

Осадочная хроматография основана на процессе образования малорастворимых осадков. Во время формирования осадочной хроматограммы происходит многократное повторение процесса образования и растворения осадков. При этом различия в растворимости образующихся осадков обусловливают разделение хроматографируемых веществ. Осадочные хроматограммы могут быть получены на колонке, хроматографической бумаге и в тонком слое. Колонки, применяемые при осадочной хроматографии, содержат носитель и осадитель. Для приготовления колонок мелко истертое вещество-носитель пропитывают раствором вещества-осадителя и высушивают (сухие колонки) или пропитывают носитель раствором осадителя и не высушивают (мокрые колонки). В качестве носителя используют индифферентное по отношению к оса дител ю и разделяемым смесям вещество, обладающее хорошей фильтрующей способностью. Вещества-носители могут быть как высокодисперсными (силикагель, оксид алюминия), так и грубодисперсными (сульфат бария). В осадочной хроматографии на бумаге роль носителя играет хроматографическая бумага. В вертикальных осадочных хроматограммах осадки равномерно распределяются по высоте зоны, образуя четкие ровные границы. Это дает возможность использовать размер зон в качестве критерия при количественном определении вещества. Осадочную хроматографию применяют в качественном и количественном анализе, для разделения и выделения веществ, концентрирования веществ и др.

Ионообменная хроматография основана на явлении обмена ионов, находящихся в растворе, и ионов, адсорбированных твердым адсорбентом, то есть на различии констант ионообменного равновесия между двумя фазами. Хроматографическую колонку заполняют анионо- или катионообменниками — твердыми веществами, имеющими ионообменные группы. В качестве таких адсорбентов применяют ионообменные смолы, или иониты (см.) — высокомолекулярные соединения, несущие диссоциирующие группы, присоединенные к структурному скелету смолы и придающие ей свойства кислоты (катиониты) или основания (аниониты). Применяются также амфотерные иониты, или амфолиты (см.), способные поглощать как катионы, так и анионы. Для разделения ионов широко применяется метод селективного элюирования. Подбирая соответствующий состав и кислотность элюирующего раствора, можно одни ионы удалять из колонки, оставляя в адсорбированном состоянии другие. Ионообменные колонки с успехом используются для разделения органических веществ. Ионы стрептомицина, напр., способны замещать в катионите ионы натрия. Аминокислоты сорбируются анионитами и могут быть элюированы раствором аммиака. При этом разные аминокислоты обнаруживаются в разных порциях элюата. Напр., для анионита вофатита порядок вытеснения аминокислот при элюировании следующий: сначала элюируется аспарагиновая кислота, затем серин, глутаминовая кислота, аланин, валин, лейцин.

Аффинная хроматография, применяющаяся для селективного выделения и очистки биологически активных веществ, в частности ферментов, основана на специфических взаимодействиях, связанных с биол. функцией выделяемого вещества, в том числе фермента. В качестве сорбента используют иммобилизованные на носителе лиганды (молекулы и ионы, связанные с определенным ионом вещества-носителя), которые избирательно связывают только определенные ферменты. Связь между молекулой фермента и лигандом осуществляется за счет нековалентных взаимодействий. Многосторонний контакт между молекулами фермента и лиганда, приводящий к высокой избирательности сорбции, обеспечивается определенным пространственным расположением функциональных групп фермента, связанным с его уникальной пространственной структурой (см. Конформация).

Молекулярно-ситовая, или гель-фильтрационная хроматография используется для разделения веществ по мол. весам. Развитие этого метода тесно связано с созданием гелей (см.), при использовании которых почти исключаются сорбционные процессы. Разделение при гель-фильтрационной хроматографии обусловлено молекулярно-ситовым действием геля благодаря различным размерам частиц разделяемых веществ и пор самого геля. При пропускании веществ с различными мол. весами (то есть с различными объемами молекул) через гель с порами определенного размера молекулы с большим объемом задерживаются лишь в порах большого размера. Поэтому они вымываются из колонки раньше молекул небольшого размера, для которых доступно большее число и, следовательно, больший суммарный объем пор. Таким образом, вещества выходят из хроматографической системы в порядке уменьшения молекулярных весов. Гель-фильтрационная хроматография применяется для разделения веществ с большими мол. весами. В биохимии и химии полимеров с помощью этого метода обессоливают и концентрируют растворы, изучают кинетику химических реакций, определяют молекулярно-весовые распределения полимеров в их смеси.

Окислительно -восстановительная хроматография (оксихроматография) основана на образовании и распределении зон хроматограмм на колонке, содержащей реагент — окислитель или восстановитель в соответствии с различной способностью анализируемых веществ к окислению или восстановлению. Наряду с распределением молекул или ионов между двумя фазами в окислительно-восстановительной хроматографии используют реакции окисления — восстановления, в которых участвуют ионы и молекулы веществ, способных окисляться или восстанавливаться. Окисление или восстановление веществ в колонке происходит в последовательности, соответствующей их окислительно-восстановительному потенциалу (см.). На окислительной колонке в первую очередь реагирует вещество с наиболее низким значением окислительно-восстановительного потенциала; на восстановительной колонке — вещество с наиболее высоким значением этого потенциала. Метод окислительно-восстановительной хроматографии используют для качественного обнаружения веществ, образующих окрашенные окисленные или восстановленные продукты.

Хроматографы. Для хроматографического анализа применяются специальные приборы — хроматографы, схемно-конструктивные решения которых обусловлены спецификой того или иного метода хроматографического анализа.

Хроматографы по типу используемой подвижной фазы делят на два основных класса: жидкостные и газовые. Жидкостные хроматографы могут работать под давлением до 30,6 мм вод. ст. (300 Па), газовые — до 0,2 мм вод. ст. (2 Па). В зависимости от особенностей неподвижной фазы хроматографы бывают колоночными и тонкослойными. Промежуточное место занимают капиллярные хроматографы, в которых тонкий слой сорбента наносят на внутреннюю стенку капилляра. По назначению хроматографы делят на аналитические и препаративные. Первые из них предназначены для качественного и количественного анализа сложных смесей, вторые — для получения хроматографически чистых компонентов таких смесей.

Хроматографы, использующие в качестве подвижной фазы газ, называют газовыми. Специфическими элементами газовых хроматографов являются разделительные колонки, система детектирования, устройство для ввода проб и термостаты.

Компоненты газовой пробы, разделенные в колонке, должны быть зарегистрированы системой детектирования, состоящей из детектора того или иного типа, измерительной схемы и самопишущего прибора. Основными требованиями, которые предъявляют к современным детекторам, являются малая инерционность, высокая чувствительность, большой динамический диапазон измеряемых концентраций. В газовых хроматографах обычно устанавливается и работает несколько детекторов.

Существуют детекторы по теплопроводности, пламенно-ионизационные, кондуктометрические, температурно-пламенные и др. Наибольшее распространение получили пламенно-ионизационные детекторы и детекторы по теплопроводности, последние применяют в том случае, когда теплопроводности анализируемых веществ и газа-носителя существенно отличаются друг от друга. Ионизация молекул в пламенно-ионизационном детекторе происходит в зоне водородного пламени. Пороговая чувствительность пламенно-ионизационных детекторов для органических веществ достигает 104 моль.

В радиоионизационных детекторах ионизация определяемых молекул осуществляется с помощью радиоактивных изотопов (например, 3Н или 147 Pm). Детектор по поперечному сечению ионизации основан на различии эффективного сечения ионизации молекул газа-носителя и анализируемых компонентов, а детектор по захвату электронов на том, что некоторые вещества, имеющие большое сродство к электронам (например, галоидные производные), способны при ионизации образовывать отрицательные ионы, вызывающие резкое уменьшение ионизационного тока. Наиболее чувствительным и универсальным является гелиевый детектор, ионизация компонентов анализируемые пробы в котором происходит за счет энергии метастабильных атомов гелия достаточной для ионизации практически всех органических и неорганических соединений и стабильных газов.

В фотоиоиизационных детекторах ионизация осуществляется за счет УФ-излучения, получаемого от специальных источников.

Наиболее совершенные хроматографы имеют системы идентификации компонентов по величине объемов, удерживаемых сорбентом. При условии постоянства скорости газового потока удерживаемый объем определяется как произведение объемной скорости газа, приведенного к стандартным условиям, на время удерживания компонента.

Для введения в разделительную колонку анализируемых проб заданных объемов с необходимой точностью предназначены дозаторы различных типов. В лабораторной практике при анализе газов и паров применяют обвшные микрошприцы, которые просты в обращении, позволяют легко изменять объем пробы и быстро вводить ее в колонку. В качестве автоматических дозаторов чаще всего используются поворотные краны с калиброванными по объему каналами или калиброванными емкостями. Калиброванная емкость под определенным давлением заполняется пробой из потока анализируемого газа или парогазовой смеси, а затем при повороте крана продувается газом-носителем и тем самым вводится в разделительную колонку.

Дозирование проб сжиженного газа или пара можно осуществить и с помощью стеклянных ампул, которые вводятся в специальные герметичные устройства и разрушаются там, где их содержимое испаряется.

Для обеспечения оптимальных температурных условий разделения хроматографы снабжены системами термостатирования разделительных колонок с программируемым изменением температуры.

В СССР выпускаются различные модели газовых хроматографов (JIXM-80; 3700, «Цвет»). Для исследовательских целей с успехом может быть использован лабораторный универсальный хроматограф JIXM-80. Хроматограф оснащен набором детекторов, имеет насадочные и капиллярные колонки. Разделение анализируемых смесей может производиться как в изотермических условиях, так и при программируемом подъеме температуры до 75— 300°.

Хроматографы, использующие в качестве подвижной фазы различные жидкости, называют жидкостными. Для обеспечения высокой эффективности разделения в жидкостных хроматографах используются калиброванные колонки из нержавеющей стали.

Особенностью жидкостного хроматографа является обеспечение непрерывной подачи жидкого растворителя, играющего роль подвижной фазы. Для этой цели применяют специальные насосы, непрерывно подающие растворитель в хроматографическую колонку без флюктуаций давления. Обычно это поршневые насосы с равномерным циклом подачи, насосы-шприцы с объемами, достаточными для работы в течение нескольких рабочих циклов, или беспоршневая подача жидкой фазы. В случае необходимости насосы могут выполнять функции устройства для градиентного элюирования. Наиболее типичное устройство для градиентной подачи подвижной фазы состоит из двух программноуправляемых насосов и смесительной камеры. Камера должна иметь достаточно малый объем, чтобы от начала смешивания до появления градиента концентрации элюирующего состава у входа в колонку проходил небольшой промежуток времени.

Установленный на выходе колонки детектор обеспечивает количественное определение концентрации разделяемых компонентов смеси в пробе, а самописец регистрирует качественный и количественный состав пробы в виде хроматограммы. Детекторы для жидкостных хроматографов должны иметь малый объем (ок. 5 мкл), обеспечивать возможность измерений в большом динамическом диапазоне, обладать хорошей линейностью, малой зависимостью от скорости тока подвижной фазы и температуры. В жидкостных хроматографах наибольшее распространение получили УФ-спектрофото-метрические, флюориметрические, рефрактометрические, поляриметрические детекторы, детекторы по теплоте адсорбции и др. Самой высокой чувствительностью отличаются УФ-спектрофотометрические и флюориметрические детекторы. С их помощью можно определить содержание вещества в пробе с концентрацией до 5 * 10-10 г/мл.

Наиболее распространенными устройствами для измерения скорости потока подвижной фазы являются ротаметры и пузырьковые отметчики времени. Последние обеспечивают точность определения, достигающую примерно 1 % , что достаточно для большинства определений, проводимых методами жидкостной хроматографии (в том числе и для определения удерживания объемов различных образцов).

В СССР освоен выпуск нескольких моделей жидкостных хроматографов. Наиболее простым и приемлемым для мед. исследований является хроматограф «Миллихром». Прибор имеет спектрофотометрический детектор и микроколонки, обеспечивающие возможность анализа проб с объемами от 2 мкл. Шведские фирмы «LKB» и «Pharmacia» выпускают хроматографы и специальные колонки для жидкостной хроматографии под большим давлением [5,1 мм вод. ст. (50 Па) — 30,6 мм вод. ст. (300 Па)] высокомолекулярных полимеров, в частности белков.

Для проведения разделения в тонком слое сорбента, а также на бумаге разработан комплект специального оборудования для тонкослойной хроматографии КТХ-01. В этот комплект входит оборудование для приготовления хроматографических пластин, нанесения проб, проявления хроматограмм хим. способом, просмотра хроматограмм (см. Денситометрия), в том числе в УФ-свете, и их фоторегистрации.

Для проведения качественного и количественного анализа веществ, меченных изотопами, дополнительно предусмотрена сцинтиляционная хроматографическая установка УСХ-1 (см. Сцинтилляция).

Библиогр.: Берчфилд Г. и Сторрс Э. Газовая хроматография в биохимии, пер. с англ., М., 1964; Бражников В. В. Дифференциальные детекторы для газовой хроматографии, М., 1974; К и б а р д и н С. А., и М а к а р о в К. А. Тонкослойная хроматография в органической химии, М., 1978; КирхнерЮ. Тонкослойная хроматография, пер. с англ., т. 1—2, М., 1981; К и с е л е в А. В. и Яш и н Я. И. Адсорбционная газовая и жидкостная хроматография, М., 1979; JI и т в и н о в JI. Д. и РуденкоБ. А. Газовая хроматография в биологии и медицине, М., 1971;НабиванецБ. И. и Мазуренко Е. А. Хроматографический анализ, Киев, 1979; Робертс Т. Радиохроматография, пер. с англ., М., 1981; Р у д е н к о Б. А. Капиллярная хроматография, М., 1978; Хроматография в биологии и медицине, под ред. М. И. Савиной и П. А. Карманова, М., 1983; Шаршунова М., Шварц В. иМихалецЧ. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии, пер. со словацк., ч. 1—2, М., 1980; Я ш и н Я. И. Физико-химиче-ские основы хроматографического разделения, М., 1976.

II. Л. Иванов; А. С. Миронов (тех.).



Популярные статьи

Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание