ЛАУРИ МЕТОД

Перейти к: навигация, поиск

ЛАУРИ МЕТОД (О. H. Lowry, амер. фармаколог, род. в 1910 г.) — метод количественного определения белка в растворах и биологических жидкостях; находит широкое применение благодаря более высокой чувствительности по сравнению с другими методами количественного определения белка. Л. м. в 10—20 раз чувствительнее метода определения белка по измерению его оптической плотности при 280 нм и в 100 раз чувствительнее биуретовой реакции (см.). Метод является общепризнанным и применяется во всех биохим, и клинико-биохим. лабораториях для определения концентрации отдельных белков, а также для контрольного анализа элюатов, содержащих смесь различных белков, при колоночной хроматографии.

Л. м. впервые был предложен Лаури и соавторами в 1951 г., с тех пор описано несколько его модификаций.

Метод основан на образовании окрашенных продуктов в результате сочетания двух реакций: биуретовой реакции на пептидную связь и реакции взаимодействия реактива Фолина—Чокалтеу с ароматическими аминокислотами, входящими в состав молекул белков (см.). Механизм образования таких окрашенных продуктов стал известен лишь к 1960 г. В ходе биуретовой реакции ионы меди и пептидные связи молекулы белка образуют внутрикомплексные соединения. Образование таких соединений облегчает транспорт электронов от наиболее хромогенных группировок молекулы белка (дипептидов, содержащих гистидин, аргинин и глутаминовую к-ту) к реактиву Фолина—Чокалтеу, в результате чего происходит восстановление этого реактива с образованием голубой окраски различных оттенков. При определении белка по Л. м. используют следующие реактивы:

A) 2 % р-р Na2CO3 в 0,1 н. р-ре NaOH;

Б) 0,5% р-р CuSO4-5H2O в 1% р-ре лимоннокислого или виннокислого натрия;

B) смесь 1 мл реактива Б с 50 мл реактива А; реактив Фолина—Чокалтеу: 20 г вольфрамовокислого натрия (Na2WO4-2H2O), 5 г молибденовокислого натрия (Na2MoO4•2H2O) растворяют в 140 мл воды, добавляют 10 мл 80% фосфорной к-ты и 20 мл концентрированной соляной к-ты. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 10 час., затем добавляют 30 г сернокислого лития, 10 мл воды и несколько капель брома. Общий объем смеси доводят водой до 200 мл и фильтруют. Реактив хранят в темной склянке;

Г) готовят непосредственно перед употреблением разбавлением реактива Фолина — Чокалтеу водой до конечной концентрации к-ты 1 н.

Ход определения: 0,4 мл белкового р-ра, содержащего от 5 до 40 мкг белка, смешивают с 2 мл свежеприготовленного реактива В и смесь оставляют стоять при комнатной температуре. Через 10 мин. к полученной смеси быстро добавляют 0,2 мл реактива Г и тщательно перемешивают пробу. Спустя 30—40 мин. измеряют величину экстинкции при 750 нм. Интенсивность развивающегося окрашивания не строго пропорциональна содержанию белка в пробе, в том случае если оно превышает 40 мкг. Поэтому рекомендуется строить калибровочную кривую в пределах от 5 до 40 мкг белка. Необходимо принимать во внимание, что разные белки дают разное окрашивание не только по интенсивности, но и по оттенку, поэтому калибровочную кривую надо строить по возможности с тем белком, содержание к-рого будет определяться в дальнейшем.

Некоторые вещества, присутствующие в белковых р-рах, мешают определению белка по Л. м. К ним относятся тритон Х-100, трис, ЭДТА, SH-реагенты, мочевина, сахароза, ионы K+, Mg2+ и др. На это обстоятельство следует обратить особое внимание, т. к. перечисленные вещества довольно часто используются в биохим, лаборатории, и количественное определение белка проводится в их присутствии. Поэтому для получения точных результатов необходимо учитывать условия, в которых проводится определение белка.

Нек-рым недостатком метода является трудоемкость приготовления реактива Фолина—Чокалтеу.


Библиография: Авдеев В.Г. Методы определения концентрации белка, Вопр. мед. хим., т. 23, № 4, с. 562, 1977, библиогр.; Бейер E. М. Некоторые данные о применимости метода Лоури в зависимости от различных условий определения белка, Лаборат, дело, № 10, с. 590, 1976: Lowry О. Н. а. о. Protein measurement with the folin reagent, J. biol. Chem., v. 193, p. 265, 1951.


Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание

Рекомендуемые статьи