ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ (лат. immunis свободный, избавленный от чего-либо + электрофорез) — метод электрофоретического разделения антигенов (или антител) в геле с последующим их проявлением посредством преципитации соответствующими антителами (или антигенами).

И. позволяет получать разнообразную информацию об отдельных компонентах сложной смеси антигенов без предварительного выделения этих компонентов в чистом виде, в т. ч. определять общее число антигенов в смеси; их относительную электрофоретическую подвижность, биохим, или энзимол, характеристики; количественное содержание каждого антигена; наличие в смеси искомого антигена; производить сравнение двух или более антигенных систем и др.

Возможности И. в характеристике антител ограничены, т. к. антитела различной специфичности, но относящиеся к одному классу иммуноглобулинов, имеют одинаковую или очень близкую электрофоретическую подвижность. С помощью И. можно установить, к какой электрофоретической фракции иммуноглобулинов — гамма1 или гамма2 — относятся исследуемые антитела. В остальном анализ антител с помощью И. не имеет каких-либо преимуществ перед их анализом методами диффузии в геле (см. Иммунодиффузия).

Наиболее широко применяемый вариант И., предложенный в 1953 г. Грабаром и Уилльямсом (P. G rabar, С. Williams), представляет собой сочетание двух отдельных методов — метода электрофоретического разделения антигенов в агаровом геле и метода встречной двумерной иммунодиффузии. Принцип первого метода основан на неодинаковой электрофоретической подвижности антигенов, обусловленной тем, что при значении pH, соответствующем условиям опыта, различные антигены будут отличаться друг от друга величиной заряда их молекул. Т. к. Изоэлектрическая точка большинства антигенов лежит в кислой области значений pH, то электрофорез обычно проводят в щелочных буферных системах, в которых антигены передвигаются с различной скоростью к аноду и к концу электрофореза занимают положения на разном расстоянии от исходной позиции.

Рис. 1. Схема электрофоретического разделения белков сыворотки в агаровом геле: в лунку (черный кружок), вырезанную в центре агаровой пластинки (ограничена рамкой), приготовленной на буферном растворе, помещена сыворотка крови; ее компоненты передвигаются к аноду (+) или к катоду (—) в зависимости от величины вектора их заряда и вектора эндосмоса; при простом электрофорезе в агаре компоненты сыворотки разделяются на четыре основные фракции (антигены)— альбумин (альб.) и α-глобулины (α-гл.), которые передвигаются к аноду, так как имеют высокий отрицательный заряд; γ-глобулины (γ-гл.) и β-глобулины (β-гл.), которые передвигаются к катоду, так как положительный вектор эндосмоса превышает вектор заряда.

Однако при использовании для электрофореза агарового геля на подвижность антигенов в электрическом поле оказывает сильное влияние так наз. электроэндосмос. Он обусловлен тем, что агар в щелочных условиях имеет отрицательный заряд, вследствие чего вблизи стенок капилляров агаровой губки скапливаются положительные ионы буфера, занимающие тем больший объем внутри капилляров, чем меньше диаметр последних и, следовательно, чем больше концентрация агарового геля. В электрическом поле эти ионы передвигаются к катоду, увлекая за собой жидкую фазу и находящиеся в ней молекулы антигенов. Т. о., в агаровом геле подвижность макромолекул определяется, с одной стороны, вектором заряда, двигающим молекулы антигена к аноду, а с другой — вектором электроэндосмоса, направленным в противоположную сторону, к катоду. Результирующая этих двух векторов будет определять скорость и направление движения антигенов в агаре. Так, напр., при электрофорезе сывороточных белков в агаре (ионная сила буфера 0,025, pH 8,6) альбумин и альфа-глобулины, имеющие высокий отрицательный заряд, передвигаются к аноду, тогда как бета- и гамма-глобулины, несмотря на отрицательный заряд их молекул, передвигаются к катоду, т. к. вектор электроэндосмоса превышает вектор заряда (рис. 1).

Рис. 2. Схема и пример иммуноэлектрофореза: 1 — схема формирования дуг преципитата при встречной диффузии в агаре антител и электрофоретически разделенных антигенов; разделенные антигены (обозначены пунктиром) диффундируют в агаре (направление диффузии указано стрелками); черный кружок — лунка с сывороткой крови; навстречу им диффундируют антитела иммунной сыворотки (направление диффузии указано стрелками). налитой в траншею после электрофореза антигенов; в местах встречи антигенов и антител образуется преципитат (осадок, выпадающий в агаре в результате соединения антигена с антителом) в форме дуг; 2 — пример иммуноэлектрофореграммы (белый кружок — лунка, стрелками указаны дуги преципитата, белая двойная полоса — траншея).

Метод встречной иммунодиффузии, применяемый на втором этапе И., основан на формировании внутри прозрачного геля видимого преципитата, образуемого в процессе встречной диффузии молекул антигена и добавленных после электрофореза молекул антител. Для осуществления встречной диффузии в агаровой пластинке вырезают траншею, к-рая располагается параллельно направлению движения антигенов и на нек-ром расстоянии от них (рис. 2). В траншею вносят иммунную сыворотку к исследуемым антигенам, после чего пластинку оставляют во влажной камере на сутки или более. За это время антитела сыворотки диффундируют из траншеи, а антигены — из мест, которые они заняли после электрофореза. В местах встречи образуется преципитат в виде дуги, форма и положение к-рой будут зависеть от количественного соотношения данного антигена и соответствующих антител и от его природы. Т. о., высокая разрешающая способность И., отличающая его от всех других методов Иммунохим, анализа, объясняется не только различной электрофоретической подвижностью и константой диффузии антигенов, но и неодинаковым отношением антиген/антитело для всех пар исследуемой системы. Чувствительность описанного варианта И. довольно высокая и позволяет определить антиген при его концентрации порядка 10 мкг/мл.

Рис. 3. Схема иммуноосмофореза с моноспецифической сывороткой, содержащей антитела к искомому антигену (антиген с анодной подвижностью): образуемый преципитат (в центре рисунка) обусловлен встречным электрофоретическим движением антигенов к аноду, а антител к катоду; метод позволяет получить быстрый ответ о наличии искомого антигена в большом количестве исследуемых проб.

В лабораторной практике часто используется другой вариант И., который в литературе часто называют иммуноосмофорезом или встречным электрофорезом. Разрешающая способность этого метода значительно ниже, и основная цель, с к-рой он применяется, заключается в получении быстрого ответа о наличии искомого антигена в большом количестве исследуемых проб с помощью моноспецифической сыворотки, содержащей антитела к этому антигену. В тех случаях, когда искомый антиген при электрофорезе в агаре передвигается к аноду, вся постановка иммуноосмофореза проводится на агаровой пластинке (рис. 3). С помощью штампа вырезают два ряда лунок (по числу исследуемых проб) диам. 2— 3 мм, расположенных друг против друга на расстоянии 3 —10 мм. Ряд лунок со стороны анода заполняют иммунной сывороткой, а лунки со стороны катода — исследуемыми пробами. Вследствие слабого заряда молекулы антител за счет электроэндосмоса будут передвигаться к катоду навстречу искомому антигену, имеющему анодную подвижность. В месте встречи образуется полоса преципитата, указывающая на присутствие антигена в исследуемой пробе. Анализ ста и более проб различного материала на присутствие искомого антигена может быть проведен с помощью иммуноосмофореза менее чем за 1 час.

Рис. 4. Схема и пример электрофореграммы при рокет-иммуноэлектрофорезе (площадь пика при постоянной концентрации антител тест-сыворотки пропорциональна концентрации искомого антигена): 1 — схема электрофореграммы, рамкой ограничена среда, состоящая из смеси агарозы с тест-антисывороткой; черные кружочки— лунки с пробами, содержащими искомый антиген в возрастающей (слева направо) концентрации; от лунок поднимаются соответствующие пики преципитата; 2 — пример рокет-иммуноэлектрофореграммы (черные кружочки — лунки с пробами, от которых поднимаются пики преципитата).

Разработаны варианты И., позволяющие получать количественную характеристику для каждого компонента исследуемой системы. Наиболее простые из них — рокeт-иммуноэлектрофорез (англ. rocket ракета) и кросс-иммуноэлeктрофоpeз. Принцип этих методов заключается в том, что электрофоретическое движение антигенов происходит в геле агарозы, смешанном с иммунной сывороткой. Рокет-иммуноэлектрофорез позволяет исследовать одновременно большое число проб и дает информацию не только о наличии искомого антигена в пробе, но и о его количестве, что придает методу большую ценность для клин, исследований. Для его постановки на стекло наливают смесь агарозы с иммунной сывороткой (лучше моноспецифической) в предварительно подобранном соотношении и затем в геле со стороны катода вырезают ряд лунок, заполняемых исследуемыми пробами. При условиях электрофореза, позволяющих антигену медленно передвигаться в агарозном геле с иммунной сывороткой, формируется преципитат в форме ракеты (рис. 4). Площадь пика при постоянной концентрации антител пропорциональна количеству антигена в пробе. При наличии референс-антигена может быть построена калибровочная кривая, по к-рой легко определять количество искомого антигена в каждой пробе по высоте сформированного пика преципитата.

Рис. 5. Схема и пример электрофореграммы при кросс-иммуноэлектрофорезе: 1 — схема: пластинку агарозы с электрофоретически разделенными антигенами соединяют с пластиной из агарозы, содержащей антисыворотку; в результате реакции иммунопреципитации на втором этапе электрофореза получаются соответствующие пики преципитатов, дающие возможность определить количество любого антигена, входящего в состав исследуемой пробы; черный кружок — лунка с исследуемым веществом; 2— пример сформированных преципитатов при кросс-иммуноэлектрофорезе.

Кросс-иммуноэлектрофорез отличается от рокет-иммуноэлектрофоре-за тем, что позволяет проводить учет тех же характеристик одновременно на нескольких компонентах исследуемой пробы, если она представляет собой сложную антигенную смесь. Исследуемую пробу сначала подвергают простому электрофорезу в агарозном геле без сыворотки. После этого полосу геля, содержащую разделенные электрофорезом антигены, вырезают и помещают на краю более широкой стеклянной пластины, заполняя оставшуюся площадь этой пластины смесью агарозы с антисывороткой. Стекло с гелем помещают в прибор для электрофореза так, чтобы направление тока было перпендикулярно направлению первого электрофореза, а заключенные в агарозе антигены располагались со стороны катода. Антигены, передвигаясь в агарозе с антисывороткой, формируют преципитат также в форме пика, но с более широким основанием за счет большей площади, занимаемой каждым антигеном в агарозе после первого простого электрофореза (рис. 5). Т. к. различные компоненты исследуемой пробы, обладая разной электрофоретической подвижностью, заняли после первого электрофореза неодинаковые позиции относительно исходной точки, то и образуемые впоследствии пики преципитата никогда полностью не накладываются друг на друга и, следовательно, могут быть четко дифференцированы. Этому способствует также различная высота пиков, обусловленная неодинаковой концентрацией антигенов, входящих в состав пробы. По сравнению с другими методами иммунохимии кросс-иммуноэлектрофорез обладает наибольшей разрешающей способностью. Количественная характеристика каждого антигена также определяется по калибровочной кривой, построенной по референс-антигену, однако определение идет не по высоте пика, а по занимаемой им площади. Чувствительность обоих рассмотренных здесь вариантов количественного И. для большинства антигенов составляет 0,5—1 мкг/мл. В тех случаях, когда рокет-иммуноэлектрофорез или кросс-иммуноэлектрофорез используются для анализа антигенов с подвижностью гамма-глобулинов или для изучения самих иммуноглобулинов, применяют предварительные методы обработки этих макромолекул, позволяющие изменить их изоэлектрическую точку путем увеличения заряда молекул. Широко применяется для этой цели реакция карбамилирования, снижающая изоэлектрическую точку иммуноглобулинов до pH 5,0.

Описанные здесь в общих чертах основные типы И. не исчерпывают всего многообразия встречающихся в литературе вариантов этого метода. Возможности этих вариантов при правильном их применении необычайно широки и позволяют получать на незначительном по количеству материале богатую информацию об исследуемых антигенах. Все более совершенствуются те варианты И., где используется изотопная метка. Эти новые методы позволяют проводить анализ материала в объеме нескольких микролитров и количественно определять искомый антиген, даже если его содержание в пробе составляет 50—100 пикограмм.


Библиография: Грабар П. и Буртэн П. Иммуноэлектрофоретический анализ, пер. с франц., М., 1963; Иммунохимический анализ, под ред. Л. А. Зильбера, М., 1968; Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу (методы и применение), под ред. Н. Аксельсена и др., пер. с англ., М., 1977, библиогр.; L a lire 11 С. В. Electroimmuno assay, Scand. J. clin. Lab. Invest., Suppl. 29, v. 124, p. 21, 1972, bibliogr.



Популярные статьи

Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание