ГРАЦИА МЕТОД

ГРАЦИА МЕТОД (A. Gratia, бельг. микробиолог; син.: метод агаровых слоев, двухслойный метод) — способ титрования бактериофага путем подсчета количества негативных колоний, образовавшихся на плотной питательной среде. Предложен в 1936 г.

Метод основан на представлении, что негативная колония возникает в результате развития отдельной корпускулы фага. Т. о., количество негативных колоний, образовавшихся после высева определенного объема титруемого фага, соответствует количеству корпускул бактериофага (см.), содержащихся в этом объеме. Установлена количественная корреляция между числом видимых в электронный микроскоп частичек и количеством негативных колоний, обнаруживаемых при титровании фага по Г. м.

Г. м. объединяет два ранее применявшихся способа титрования бактериофага: 1) глубинный агаровый, при к-ром определенный объем титруемого фага смешивают с чувствительной культурой, а затем к смеси добавляют расплавленный питательный агар, после чего смесь выливают в чашку Петри (недостаток способа— распределение фага по всей толщине агара, что затрудняет подсчет образовавшихся негативных колоний); 2) метод поверхностного нанесения: приготовленную из чувствительной культуры и определенного объема титруемого фага смесь наносят петлей или пастеровской пипеткой на поверхность питательного агара в чашке Петри (см. Петри чашки). Недостаток второго способа заключается в том, что на поверхность агара можно нанести 0,1 мл смеси— количество, недостаточное для точных определений; посевы негомогенные, распределение фага неравномерное.

Г. м. дает возможность исследовать достаточно большие объемы фага (0,5—1 мл), добиться равномерного распределения его в поверхностном слое среды, что облегчает подсчет количества негативных колоний.

Негативные колонии бактериофага, оттитрованного по методу Грациа.
Негативные колонии бактериофага, оттитрованного по методу Грациа.

Для проведения титрования необходимо иметь следующие питательные среды: 1,5% мясо-пептонный агар, 0,7% мясо-пептонный агар, физиол, р-р поваренной соли. Накануне опыта 1,5% мясо-пептонный агар или другую питательную среду разливают по чашкам Петри в количестве 25—30 мл. Чашки, прикрытые стерильными бумажками, подсушивают в течение нескольких часов в термостате или боксе при ультрафиолетовом облучении. При работе с фагами кишечной группы рекомендуется к 1,5% агару добавить генциан-виолет (0,1 мл 0,4% спиртового р-ра краски на 1 л агара); это предохранит среду от прорастания флорой воздуха. В день опыта 0,7% агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляют и помещают в водяную баню при t° 46°. Затем титруемый фаг десятикратно стерильно разводят в пробирках бульоном или другой питательной средой так же, как при титровании по методу Аппельмана (см. Аппельмана метод). К 2,5 мл расплавленного 0,7% агара добавляют 1 мл фага соответствующего разведения и 0,1 мл смыва агаровой культуры, чувствительной к фагу. Смыв готовят с косяка 5 мл бульона или физиол. р-ра поваренной соли. Содержимое пробирки быстро перемешивают, вращая ее между ладонями, и выливают в чашку Петри с подсушенным 1,5% агаром. Слегка покачивая чашку, добиваются равномерного распределения 0,7% агара по поверхности 1,5% агара. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности стола до застывания верхнего слоя агара, перевертывают и помещают в термостат при t° 37° на 4,5 час., а затем оставляют их при комнатной температуре на 24— 36 час. В результате в верхнем слое агара образуются прозрачные негативные колонии на непрозрачном фоне бактериального роста (рис.).

При проведении титрования следует избегать длительного хранения 0,7% агара при t° 46 °, т. к. примерно через 1 час он начинает густеть, превращаясь в гель, что снижает количество выявляемых колоний. Титр фага, определяемый по Г. м., выражается количеством корпускул фага, способных образовывать негативные колонии в 1 мл фага. Так, напр., если при высеве 1 мл фага, разведенного до 10-7, на чашке образовалось 35 колоний, то титр такого фага равен 3,5 X 108 корпускул/мл.


Библиография Gratia A. Des relations nu-m6riques entre bacteries lysogfcnes et parti-cules de bacteriophage, Ann. Inst. Pasteur, t. 57, p. 652, 1936; Methods in medical research, ed. by J. H. Comroe, v. 2, p. 7, Chicago, 1953.



Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание