ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ

ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ (син. гель-хроматография) — метод разделения смеси веществ с разными молекулярными весами путем ее фильтрации через различные поперечно-связанные ячеистые гели.

Г.-ф. широко применяется в различных областях химии, биохимии, медицины и др. для анализа смеси соединений с различными мол. весами. Метод прост по технике выполнения, проводится в мягких условиях, что позволяет использовать его для работы с весьма нестойкими соединениями, напр, ферментами. Г.-ф. используется для определения величин мол. весов, концентрирования растворов полимеров, изучения некоторых физ.-хим. свойств макромолекул и т. п.

В медицине Г.-ф. служит вспомогательным средством в диагностике. Так., напр., фракционирование белков плазмы крови на сефадексе G-200 используется для быстрой диагностики заболеваний, сопровождающихся резкими нарушениями состава белков плазмы. С помощью Г.-ф. сыворотки на сефадексе G-200 удается отдифференцировать болезнь Вальденстрема (макроглобулинемия) от плазмацитомы, что невозможно сделать электрофоретически. Г.-ф. используется для ранней диагностики беременности, для определения качественного состава белков в микроколичествах цереброспинальной жидкости и т. д.

Благодаря множеству модификаций Г.-ф. применяется для работ на микроуровне и в препаративных целях.

Для Г.-ф. используют преимущественно хроматографические колонки (см. Хроматография). Наполнителем служит гранулированный гель (см. Гели); для исследования смеси растворенных в воде соединений используют гидрофильные гели (гели сефадексов — декстранов, биогели и др.); фракционирование гидрофобных полимеров осуществляют с помощью фильтрации через липофильные гели.

Колонка с гелем, набухшим в соответствующем растворителе, имеет два вида объемов этого растворителя: внутренний и наружный. Прохождение веществ с различными мол. весами через колонку определяется размерами пор между гранулами геля. Вещества, молекулы которых значительно меньше, чем размеры пор гранул, будут свободно диффундировать внутрь этих гранул. Поэтому крупные молекулы будут перемещаться по колонке с большей скоростью, чем мелкие.

Коэффициент распределения (Кр) растворенного вещества между внутренним и внешним объемами определяется из уравнения Kp = (Vэ-Vн)/Vв, где Vэ—объем жидкости, вытекающий из колонки с момента нанесения на нее исследуемого раствора до появления фракции с максимальной концентрацией вещества, интересующего экспериментатора; Vв—объем растворителя, находящийся внутри гранул геля, a Vн—объем растворителя вне гранул геля.

Если Кр равно 0, то вещество не способно проникать внутрь гранул. При Кр = 1 вещество распределяется равномерно между внешним и внутренним объемами.

При пропускании через колонку элюирующего раствора в первую очередь начинают перемещаться вещества, находящиеся во внешнем объеме. Т. о., компоненты исследуемой смеси элюируются с колонки в порядке уменьшения мол. веса.

Для элюции (см.) при Г.-ф. обычно используют разбавленные солевые или буферные растворы, т. к. при элюции чистой водой целый ряд соединений сорбируется матрицей геля. Взаимодействуют с матрицей и некоторые белки (РНК-аза, лизоцим, трипсин, сывороточный альбумин и др.)

Эффективность разделения при Г.-ф. не зависит от концентрации веществ в растворе. Однако, если вязкость исследуемого раствора очень высока, то качество разделения ухудшается.

Для обессоливания или смены буферного раствора колонку наполняют гелем, набухшим в новом буферном растворе, после чего наносят исследуемую пробу. Белок (или другое высокомолекулярное соединение) элюируется в новом буферном растворе после вытекания объема Vн. Исходный буферный раствор и другие ионы, содержащиеся в нем, появляются после прохождения объема, равного Vн + Vе.

Определение мол. веса методом Г.-ф. основано на том, что практически объем выхода вещества с колонки является линейной функцией логарифма величины мол. веса. Прежде чем проводить определение мол. веса неизвестного полимера, необходимо прокалибровать колонку с помощью полимеров с известным мол. весом (стандартов). Зная объем выхода исследуемого вещества, по калибровочной кривой определяют искомую величину мол. веса.

Определение мол. веса ферментов можно производить в неочищенных препаратах и в сильно разведенных растворах; Г.-ф. позволяет также исследовать обратимо диссоциирующие системы, изучение которых с помощью других методов достаточно трудоемко.

См. также Гели.


Библиография: Детерман Г. Гель-хроматография, пер. с нем., М., 1970; T и-хоненко Т. И. Методологические основы биохимии вирусов, М., 1973, библиогр.



Популярные статьи

Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание

Поделиться: