БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ (в диагностике) — методы исследования химических компонентов биологических жидкостей, клеток и тканей, а также процессов превращения веществ и энергии, протекающих в организме человека в норме и патологии. Для целей клинической диагностики представляет интерес: химический состав биологических жидкостей и тканей организма (патология может проявляться изменением концентрации, или отсутствием одного из обычных компонентов, или появлением необычного компонента), распределение жидкости и химических компонентов между различными «структурами» организма и отдельной клетки, процессы превращения химических компонентов в целом организме или различных его органах и их регуляция с помощью медиаторов, гормонов, тканевых гормонов, ферментов; процессы обмена организма с внешней средой. Исследованию подвергаются входящие в состав живых организмов неорганические, органические вещества и макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Исследование может проводиться in vitro в пробах биологических жидкостей (кровь, моча, цереброспинальная жидкость, нот, пищеварительные соки и т. д.), патологических жидкостей (отечной, асцитической, плевральной, перикардиальной, внутрисуставной и т. д.) или ткани, а также выдыхаемого воздуха, in vivo с помощью введенных в организм датчиков (ионоселективных электродов).

В диагностической практике наибольшее распространение получили Б. м. и. отдельных хим. компонентов, их соединений и соотношений между ними в пробах биол, жидкостей (кровь, моча и т. д.). В зависимости от характера исследования Б. м. и. могут быть разделены на качественные (обнаружение искомого вещества в пробе биол, жидкости или ткани) и количественные (определение или измерение его содержания). Качественные методы (см. Аналитическая химия) большей частью основаны на использовании характерного для исследуемого вещества свойства, проявляющегося при определенном хим.-физ. воздействии (прибавление соответствующего реагента, нагревание и т. п.). Этот же принцип лежит в основе прямых количественных методов исследования. Однако поскольку состав биол, жидкостей довольно сложен, при количественном определении хим. компонента обычно в качестве первого этапа исследования выделяют из биол, жидкости искомое вещество (или группу близких веществ), а затем идентифицируют его (по тому или иному характерному свойству) и измеряют содержание (концентрацию). В ряде случаев разделение веществ, идентификация и измерение концентрации могут быть проведены одномоментно, напр, при исследовании биол, жидкости методом газовой хроматографии (см. Хроматография). Принципы химических, физических и физико-химических методов, применяемых при биохим, анализе, приведены в табл. 1 и 2.

При исследовании ферментов большей частью измеряют не их концентрацию, а результат проявления их каталитической активности (уменьшение содержания субстрата или увеличение содержания продукта реакции, катализируемой ферментом). Ряд веществ, обладающих высокой биол, активностью, но содержащихся в организме в малых количествах (гормоны, медиаторы), выделяют тем или иным хим. способом, а измерение содержания (концентрации) производят с помощью биол, тест-объектов (изолированных органов или целых организмов экспериментальных животных), что повышает чувствительность и специфичность исследования. В последнее время эти биол, методы вытесняются радиоиммунологическими.

Совершенствование Б. м. и. направлено на получение наиболее точной информации о состоянии процессов обмена вещества в целом организме, в определенном органе, в отдельной клетке, в субклеточных структурах. Б. м. и. при этом сочетаются с методами иммунологии, гистологии, цитологии и др. Такие методы обычно сложны, трудоемки, требуют специального оборудования.

Другим направлением развития Б.М. невызываемого запросами клинической диагностики, является разработка и применение максимально упрощенных по технике выполнения и быстрых методов, позволяющих в течение нескольких минут и даже секунд получить приближенную (ориентировочную) оценку определенного биохим, показателя. Б. м. и. могут осуществляться с помощью частично или полностью механизированных систем, автоматических измерительных приборов, автоанализаторов (см.). Как выделение вещества из биол, жидкости, так и измерение его концентрации может быть осуществлено различными способами. Комбинации этих способов, представляющие собой конкретные методы исследования, довольно многочисленны. В отношении некоторых веществ (холестерин, холинэстераза) описано до 100—150 вариантов методов исследования. Известная специфика метода исследования может быть обусловлена характером исследуемой биол, жидкости в зависимости от концентрации белка, пигментов и т. п. Наряду с однократными исследованиями в диагностике представляет интерес изучение того или иного показателя в динамике — в течение суток (оценка нормального суточного ритма), под влиянием определенной функциональной нагрузки (выявление скрытых дефектов метаболизма), в процессе развития болезни, под влиянием лечения. В связи с многообразием биохимических процессов, одновременно протекающих в процессе жизнедеятельности организма, в практике все шире применяются комбинации диагностических тестов, отражающих ту или иную форму патологии, поражение определенного органа, глубину или стадию патологического процесса.

Применение Б. м. и. в диагностике предъявляет к ним особые требования: использование минимального объема биол, материала, быстрое выполнение анализа, возможность многократного применения при проведении функциональных проб, отсутствие влияния леч. препаратов на результаты исследования и т. д. При оценке Б. м. и. учитывается: правильность и воспроизводимость результатов от одного определения к другому, точность полученного результата истинному содержанию искомого вещества в пробе, специфичность (способность выявлять вещество независимо от присутствия других веществ) и предел чувствительности (наименьшее количество вещества, к-рое можно определить данным методом).

Разнообразие Б. м. и. предоставляет возможность выбора метода, оптимально соответствующего задачам и условиям научного исследования. В практической деятельности клинико-диагностических лабораторий более целесообразно использовать тщательно отобранные унифицированные методы, единые для всех леч.-проф, учреждений страны, что позволяет сравнивать результаты анализов, проведенных одному и тому же больному в разных учреждениях, и облегчает материально-техническое снабжение лабораторий. В СССР проводится планомерная унификация наиболее часто применяемых в диагностических целях Б. м. и. с учетом научно-мед. и экономических критериев. Отечественная номенклатура лабораторных диагностических исследований насчитывает 150 биохим, тестов.


Таблица 1. ПРИНЦИПЫ МЕТОДОВ РАЗДЕЛЕНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Свойство, используемое для разделения веществ

Методы разделения и выделения

Свойство, используемое для разделения веществ

Методы разделения и выделения

Различие температур перехода вещества из одного состояния в другое

1.    Перегонка (дистилляция)

2.    Микродиффузия (изотермическая дистилляция)

3.    Выпаривание (высушивание)

4.    Сублимация

Различие распределения между подвижной и неподвижной фазами (на основе различия растворимости, сорбируемости, величины молекул или электрического заряда)

(продолжение)

10.2.2. Разделительная (жидкая стационарная фаза)

10.2.2.1.    Жидкостно-жидкостная

10.2.2.2.    Газо-жидкостная 10.3. Гельхроматография

10.3.1.    Гельфильтрация

10.3.2.    Гельхроматография

10.3.3.    Разделение без различия величины молекул

10.4. По технике осуществления

10.4.1.    Колоночная

10.4.2.    Тонкослойная

10.4.3.    Бумажная

Различие растворимости

5.    Экстракция

6.    Противоточное распределение

7.    Фракционное осаждение (по видам осаждающих агентов и средств)

7.1.    Нейтральные соли

7.2.    Гидрофильные органические растворители

7.3.    Водорастворимые недиссоциирующие высокомолекулярные полимеры

7.4.    Тяжелые металлы и их гидроокиси

7.5.    Органические катионы

7.6.    Анионы и полианионы

7.7.    Иммунопреципитация

Различие в электрическом заряде молекул

11.    Электрофорез

11.1.    Свободный

11.2.    На носителях

11.2.1.    На бумаге

11.2.1.1.    Простой

11.2.1.2.    Высоковольтный

11.2.2.    На геле агара

11.2.3.    На геле агарозы

11.2.4.    На крахмальном геле

11.2.5.    На полиакриламидном геле

11.2.5.1.    Простой

11.2.5.2.    Диск-электрофорез

11.2.5.3.    Пластинчатый

11.2.6.    На пленке (ацетатоцеллюлозы)

11.2.7.    На тонком слое

12.    Комбинированный электрофорез

12.1.    Электрофорез + иммунодиффузия (Иммуноэлектрофорез)

12.2.    Электрофорез + хроматография (техника «отпечатков пальцев»)

Различие скорости седиментации

8. Седиментационный анализ

8.1.    Центрифугирование

8.2.    Ультрацентрифугирование

8.2.1.    При разных скоростях осаждения частиц

8.2.2.    Изопикническое

8.2.3.    При зональных роторах

Различие величины молекул

9. Диализ

9.1.    При равном давлении

9.2.    При повышенном давлении

9.3.    При пониженном давлении (ультрафильтрация)

9.4.    Электродиализ

9.5.    Диализ через нестационарную мембрану

Различие в электрическом заряде молекул при определенной величине pH

13. Изоэлектрическое фокусирование в градиенте pH

13.1.    Свободное

13.2.    Зональное

13.3.    В геле

13.4.    Иммуноэлектрофокусирование

Различие распределения между подвижной и неподвижной фазами (на основе различия растворимости, сорбируемости, величины молекул и электрического заряда)

10. Хроматография

10.1.    По виду процессов разделения

10.1.1.    Элюционная

10.1.2.    Фронтальный анализ

10.1.3.    Вытеснительная

10.1.4.    Термохроматография

10.2. По принципу разделения и стационарной фазе

10.2.1.    Адсорбционная (твердая стационарная фаза)

10.2.1.1.    Жидкостно-адсорбционная

10.2.1.2.    Ионообменная

10.2.1.3.    Газо-адсорбционная

Различие подвижности в электрическом и магнитном поле комплекса вещества с заряженными частицами

14. Диэлектрофорез


Таблица 2. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Физико-химические свойства веществ, используемые в анализе

Методы определения (измерения)

Физико-химические свойства веществ, используемые в анализе

Методы определения (измерения)

Экстенсивные

свойства

Масса (вес)

Объем

1.    Гравиметрия (весовые методы)

2.    Волюмометрия

2.1.    Газоволюмометрия

2.2.    Титриметрия

2.2.1.    Нейтрализационный анализ

2.2.2.    Редоксиметрия

2.2.3.    Комплексометрия, в т. ч. комплексонометрия

2.3.Объемная седиментометрия

Взаимодействие вещества с лучистой энергией

Поглощение лучистой энергии: рентгеновских лучей, ультрафиолетовых лучей, видимых лучей, инфракрасных лучей

Рассеяние и отражение света

Преломление световых лучей (показатель преломления) Вращение плоскости поляризованного света

19. Адсорбционная спектроскопия (спектрофотометрия)

19.1.    Рентгеноспектрофотометрия

19.2.    В ультрафиолетовом свете

19.3.    В видимом свете

19.4.    В инфракрасном свете

19.5.    Атомно-адсорбционная спектрофотометрия

20.1.    Нефелометрия

20.2.    Турбидиметрия

21.1.    Рефрактометрия

21.2.    Интерферометрия

22.    Поляриметрия

23.    Электронная парамагнитнорезонансная спектроскопия

24.    Ядерная магнитнорезонансная спектроскопия

25.    Масс-спектрометрия

Механические

свойства

Плотность (уд. вес) Вязкость Осмотическое давление

3.    Денсиметрия

4.    Вискозиметрия δ. Осмометрия

5.1.    Прямая осмометрия

5.2.    Криоскопия

Термические

свойства

Температура фазовых превращений (плавления, кипения, замерзания)

Теплота реакций (сгорания, нейтрализации)

Теплопроводность (газа)

6.    Термометрия

6.1.    Термометрия

6.2.    Термогравиметрия

6.3.    Дифференциальный термический анализ

7.    Калориметрия

8.    Термокондуктометрия

Дифракция рентгеновских лучей и электронов

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) Отклонение ионизированных молекул электрическим и магнитным полем

Электрические

свойства

Электропроводность

Диэлектрическая

проницаемость

Магнитная восприимчивость

Сила диффузионного тока на электроде при реакции восстановления или окисления

Количество электричества для реакции на электроде Электродный потенциал

9. Кондуктометрия

10.    Диэлкометрия

11.    Импедансометрия

12.    Электроспектроскопия

13.    Абсорбционная импедансометрия

14.    Магнитометрия

15.    Амперометрия

16.    Полярография

16.1.    При контролируемом напряжении

16.2.    При контролируемом токе

16.3.    При отслаивании вещества с анода

16.4.    Пульсационная

17.    Кулонометрия

18.    Потенциометрия

18.1.    С обычными электродами

18.2.    Сион-селективными электродами

18.2.1.    Мембрана из специального стекла

18.2.2.    Твердая мембрана

18.2.2.1.    Гомогенная

18.2.2.2.    Гетерогенная

18.2.3.    Жидкая мембрана

18.2.3.1.    Ион-селективный компонент имеет заряд

18.2.3.2.    Ион-селективный компонент нейтрален

18.2.4.    Мембрана с закрепленным ферментом

Испускание излучения

Под воздействием высокой температуры, под воздействием возбуждающего света, теплоты или химической реакции, рентгеновских лучей

26. Эмиссионная спектроскопия (спектрофотометрия)

26.1.    Фотометрия пламени

26.2.    Флюориметрия (измерение люминесценции и хемилюминесценции)

26.3.    Лазерная спектроскопия

26.4.    Рентгеновская флюориметрия

Ядерные свойства

Радиоактивность

27.1.    Нейтронный активационный анализ

27.2.    Радиоиндикаторный анализ

2 7.3. Метод изотопного разведения 27.4. Сатурационный анализ

27.4.1.    Радиоиммунологический анализ

27.4.2.    Конкурентное связывание

Химические

свойства

Скорость химических i реакций

28.1. Кинетические методы


Библиография: Асатиани В. С. Биохимическая фотометрия, М., 1957, библиогр.; он же, Новые методы биохимической фотометрии, М., 1965, библиогр.; Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, М., 1969; Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований, под ред. В. В. Меньшикова, М., 1973; Юинг Г. В. Инструментальные методы химического анализа, пер. с англ., М., 1960; Arbeits-methoden der inneren Medizin und ihr verwandter Gebiete, hrsg. v. R. Emmrich, Bd 5, Lfg 1, Jena, 1969; Automation in analytical chemistry, В. a. o., 1972; Henry R. J. Clinical chemistry, N. Y., 1964, bibliogr.; Homolka J. Klinick6 bio-chemick£ vySetfovaci metody, Praha, 1971, bibliogr.; R e h f e 1 d N. u. R e ίο h e 1 t D. Analytische und praparative Methoden der klinischen Biochemie, B.,1972; R ichterich R. Klinische Chemie, Basel uv a., 1971.


Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание