ЭНЗИМ-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

ЭНЗИМ-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД (синоним реакция энзим-меченых антител) — серологическая реакция, основанная на взаимодействии антигена с антителом, химически связанным с энзимом (ферментом). Образовавшийся комплекс антиген— антитело приобретает ферментативную активность и расщепляет соответствующий субстрат с цветным или люминесцентным эффектом.

Энзим-иммунологический метод в 10—100 раз чувствительнее классических серологических реакций (см. Серологические исследования), по чувствительности он приближается к радиоиммунологическому методу (см.). Энзимиммуно логический метод может использоваться не только для титрования антител, но также для обнаружения антигенов, микробов, например вирусов или вирусных антигенов.

Энзим-иммунологический метод применяют при лабораторной диагностике бруцеллеза, холеры, туберкулеза, риккетсиозов, кори, краснухи, гриппа, клещевого энцефалита, а также паразитарных инфекций (малярии, шистосоматоза, трипаносомоза, токсоплазмоза), так как другие серологические методы при этих заболеваниях мало эффективны.

Для метки антител чаще используют пероксидазу хрена и щелочную фосфатазу, а также (З-Б-галактози-дазу, глюкозидазу, глюкоамилазу, ацетилхолинэстеразу, пенициллиназу и другие ферменты. Для конъюгации фермента с иммуноглобулином (антителом) применяют глутаровый альдегид или периодат натрия. Субстратом для иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, служит ортофенилендиамин, при расщеплении которого среда окрашивается в коричневый цвет. Для иммуноглобулинов, меченных щелочной фосфатазой, берут 4-нитрофенилфосфат, продукты его расщепления дают зеленое окрашивание. Кроме названных хромогенных субстратов существуют люмогенные, которые после расщепления светятся в УФ-лучах.

Различают прямой энзим-иммунологический метод, когда антиген реагирует с меченым антителом, и непрямой энзим-иммунологический метод, при котором комплекс антиген — антитело выявляется меченой антииммуноглобулиновой (анти-IgG) сывороткой. Прямой метод используют главным образом для индикации антигена, а непрямой — для выявления и титрования антител.

При экспресс-диагностике бешенства отпечатки мозга больных животных на предметном стекле фиксируют ацетоном и наносят на препарат меченную пероксидазой антирабическую сыворотку. Через 1 час инкубации при t° 37° на препарат наносят субстрат—сульфат-диамино-бензидин, приготовленный на трис-буфере (pH 7,4) с добавлением перекиси водорода. Через 5 минут препараты отмывают водой и исследуют с помощью светового микроскопа. При положительном результате в цитоплазме клеток обнаруживают специфические для бешенства включения — тельца Негри, окрашенные в коричневый цвет (см. Бешенство). При непрямом методе препарат сначала обрабатывают немеченой кроличьей антирабической сывороткой, которая вступает в связь с антигеном, а затем этот комплекс выявляют путем добавления меченого антикро-личьего глобулина и субстрата.

Для титрования антигенов и антител в жидкой среде один из реагентов иммобилизуют на твердом носителе, например на поверхности лунок микропланшетов из полистирола. Эту модификацию реакции называют твердофазным иммуноферментным методом (ТИФМ), который в зарубежной медицинской литературе известен как ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Для выявления, например, противокоревых антител в лунки микропланшетов вносят очищенный антиген вируса кори и оставляют для адсорбции на 18—20 часов при f 4°. Несвязавшийся антиген отмывают, в лунки добавляют исследуемую сыворотку в разведении 1:50 и оставляют на 2 часа при f 37°. Затем лунки тщательно промывают и вносят в них меченную пероксидазой иммунную к глобулинам человека сыворотку. Затем снова отмывают и добавляют субстрат — ортофенилендиамин. При положительном результате (наличие антител в исследуемой сыворотке) субстрат изменяет цвет на желтокоричневый, лунки микропланшетов с сыворотками без антител остаются бесцветными. Реакцию можно оценивать невооруженным глазом, но лучше с помощью спектрофотометра. Применяя меченые анти-IgM и анти-IgG сыворотки, можно одновременно обнаруживать антитела и определять класс иммуноглобулинов, к которым они относятся. Лунки микропланшетов покрывают иммуноглобулином, содержащим антитела к исследуемому антигену, например к вирусу; затем вносят пробу, в которой ищут антиген (вирус). Если в пробе есть антиген, то он связывается с антителами. При последующем добавлении специфической к искомому антигену меченой сыворотки она соединяется со свободными рецепторами вируса и разлагает внесенный вслед за тем субстрат.

Библиогр.: Воллер А., Бидуэлл Д. и Бартлет А. Иммунофер-ментативные реакции в диагностической медицине, Бюлл. ВОЗ, т. 53, № 1, с. 38, 1977, библиогр. С. Я. Гайдамович.


Популярные статьи

Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание

Поделиться: