ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ — направленное перемещение электрически заряженных частиц дисперсной фазы в дисперсионной среде (или ионов в электропроводящем растворе) под действием внешнего электрического поля. Метод электрофореза широко используется в биологии и медицине для выделения и анализа индивидуальных белков (см.), нуклеиновых кислот (см.) и других биополимеров, вирусов, надмолекулярных клеточных структур, а также целых клеток. В иммунологии одним из наиболее употребляемых методов исследования является иммуноэлектрофорез (см.) — электрофоретическое разделение смеси антигенов или антител в геле с последующий их преципитацией. Путем микроэлектрофореза(см. Микроионофорез) в клетку можно ввести или к ней подвести любые вещества, способные диссоциировать на ионы (см.). Микроионофорез является одним из основных современных методов в нейрофизиологических, нейрофармакологических, нейрохимических исследованиях. Большое диагностическое значение имеют электрофоретическое разделение ферментов (см.) на коферменты (см.) и их количественная и качественная оценка. Введение лекарственных веществ в организм путем Э. широко применяется в физиотерапии (см.).

Электрофорез наряду с электроосмосом (см.) был открыт в 1807 году профессором Московского университета Рейссом. Электрокинетические явления (см.), к которым относят электрофорез, обусловлены наличием на границе раздела фаз двойного электрического слоя и способностью диффузной части этого слоя смещаться относительно адсорбционно связанной (неподвижной) его части. Электрический потенциал поверхности, разделяющей подвижную и неподвижную части двойного электрического слоя, носит название электрокинетического или ζ (дзета)-потенциала. Частицы дисперсной фазы, находящиеся в буферном растворе (см. Буферные растворы), несут определенный суммарный электрический заряд, величина и знак которого зависят от величины pH среды (см. Водородный показатель). Если через буферный раствор, заключенный в сосуд с электроизолирующими стенками, например, в стеклянную трубку, пропускать электрический ток, то результатом этого будет появление определенного градиента напряжения (см. Градиент), или электрического поля. Под действием этого поля частицы дисперсной фазы в соответствии со знаком суммарного заряда движутся в направлении катода, то есть происходит катафорез, или анода — анафорез. В зависимости от величины заряда и своих размеров частицы в электрическом поле приобретают разные скорости. Смесь разнородных частиц, внесенная в узкую зону, в этих условиях разделяется на зоны, образуемые частицами, движущимися с одинаковой скоростью, то есть обладающими одинаковой электрофоретической подвижностью.

Электрофоретическая подвижность частиц, имеющих сферическую форму (V), выражается формулой Смолуховского: V = ( ζD)/(4πη), где ζ — электрокинетический потенциал двойного электрического слоя, окружающего частицу, D — диэлектрическая проницаемость и η — вязкость среды. В том случае, когда электрофоретическое разделение смеси частиц (или молекул) производят в буферных растворах с не слишком низкими (например, около 0,1) значениями ионной силы раствора (полусуммы произведений концентраций всех находящихся в растворе ионов на квадрат величины их заряда), частицы группируются по фракциям лишь по величине заряда без учета размеров или молекулярных весов (масс), если речь идет о молекулах.

Рис. 1. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови здорового человека в приборе Тизелиуса (оптическая запись). Стрелкой указано направление движения фракций в поде постоянного электрического тока в боратном буфере, pH 6,8. Отдельные пики на электрофореграмме (1—5) со ответствуют γ-, β-, α2-, α1- глобулинам и альбумину сыворотки крови. Пользуясь графиком, можно вычислить относительное содержание каждой фракции, приняв площадь, ограниченную базовой линией и кривой за 100%; «—» и «+» — катод и анод.

Использование электрофореза в биологии и медицине началось в 30-е годы 20 века, когда А. Тизелиус разработал метод электрофореза в свободной жидкости и сконструировал прибор для электрофоретического разделения и анализа смеси белков так называемым методом подвижных, или свободных, границ. В медико-биологических исследованиях применяют множество вариантов двух главных модификаций электрофоретического метода — электрофореза в свободной жидкости (свободнопроточный электрофорез) и зонального электрофореза (зонный электрофорез, или электрофорез на инертных носителях). Первым был разработан электрофорез в свободной жидкости (метод подвижных границ, электрофорез по Тизелиусу), который позволял измерять электрофоретическую подвижность испытуемого вещества по перемещению подвижной границы между чистым буферным раствором и буферным раствором, содержащим исследуемое вещество. В приборе Тизелиуса используется оптический метод регистрации положения такой границы по определению показателя преломления среды (см. Нефелометрия, Рефрактометрия), а в некоторых случаях — прямое микроскопирование. При разделении смеси веществ с различными изоэлектрическими точками (см. Изоэлектрическая точка) оптические устройства регистрируют несколько движущихся пиков (рис. 1). Основным недостатком электрофореза в свободной жидкости является ее тепловое движение, мешающее четкому разделению фракций и размывающее границы зон. Этот недостаток частично преодолевается созданием градиентов плотности буферных растворов (например, с помощью сахарозы). При фракционировании низкомолекулярных веществ, чтобы избежать чрезмерного размывания зон, применяют высоковольтный электрофорез, иногда в сочетании с хроматографией (см.) — так называемый метод «отпечатков пальцев».

Рис. 2. Схема простейшего прибора для электрофореза в геле: а — до начала фракционирования; б — после окончания фракционирования; «—» и «+» — катод и анод; 1 — рабочий канал (стеклянная трубка); 2 — электродные резервуары (через находящийся в них буферный раствор и рабочий канал замыкается электрическая цепь между электродами); 3 — место внесения в гель смеси, подлежащей электрофоретическому разделению; поперечные полосы в пределах фигурной скобки,— зоны, образовавшиеся в результате электрофореза.

Зональный электрофорез отличается от электрофореза в свободной жидкости главным образом использованием нейтральной поддерживающей среды (инертных носителей) для жидкой фазы (буферного раствора), что сводит к минимуму эффект теплового движения и позволяет при необходимости выделить тот участок носителя, который содержит индивидуальное вещество. В качестве инертных носителей в зональном электрофорезе используют специальную хроматографическую бумагу, полоски ацетата целлюлозы, тонкие слои силикагеля, порошка целлюлозы или гели сефадексов (см. Декстран). Зональный электрофорез на инертных полимерах-носителях позволяет фракционировать вещества не только по величине заряда, но и по молекулярному весу. Особое место среди таких носителей занимают гели полиакриламида (ПААГ) и агарозы. Преимущество полиакриламидных гелей заключается в возможности изменения диаметра их пор при изменении концентрации полимера, а также в отсутствии явлений адсорбции и электроосмоса при электрофорезе.

При электрофоретическом разделении гетерогенной смеси в полиакриламидном геле колонку небольшого сечения (около 1 см2) заполняют буферным раствором, содержащим растворенный мономер (акриламид; CH2—CH— CONH2, небольшое количество вещества-сшивателя (бис-N-метиленметакриламида — НС(СН2)—CONH—CH2-NHCO-(CH2)CH ) и вещество-инициатор полимеризации. Через некоторое время при комнатной температуре в колонке образуется однородный гель (рис. 2). Если с помощью электрофореза в свободной жидкости по Тиэелиусу в сыворотке крови обнаруживают 5 белковых фракций (см. рис. 1), то при электрофоретическом разделении сыворотки крови в полиакриламидном геле их насчитывают не менее 25 (рис. 3).

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле значительно повышается при использовании в качестве носителя системы гелей (обычно двух — «рабочего» мелкопористого и непосредственно над ним «формирующего» крупнопористого). Кроме степени пористости, эти гели резко различаются по величине pH и молярности буферных растворов, в которых они полимеризуются. Такой электрофорез называют ступенчатым, или дискэлектрофорезом (английский (discontinuous - прерывистый).

Вариантом электрофореза в полиакриламидном геле является электрофорез смеси биополимеров после предварительной обработки денатурирующим агентом с целью изменения конфигурации молекул. Белки в этом случае обрабатывают ионным детергентом (см.) — додецилсульфатом натрия, разрушающим дисульфидные связи в их молекулах и образующим с ними отрицательно заряженные мицеллы, заряд которых пропорционален молекулярному весу белка; нуклеиновые кислоты подвергают электрофорез в присутствии щелочи, мочевины, формамида или других агентов, разрушающих водородные связи в полинуклеотидных цепях нуклеиновых кислот. При этих условиях электрофоретическая подвижность биомолекул начинает строго коррелировать с их молекулярным весом.

Рис. 3. Схематическое изображение расположения белков сыворотки крови при электрофорезе на бумаге или ацетате целлюлозы (I) и в полиакриламидном геле (II): А — альбумин; γ-, β-, α2-, α1 — Фракции соответствующих глобулинов; пре-А — преальбумин; α1-ГП — α1-гликоиротеид кислый (α1-серомукоид); АТ — α1-антитрипсин; Ц — церулоплазмин; ТФ—трансферрин; Г — гемопексин; ПФЛ — плазминоген (профибринолизин); IgA + IgG — иммуноглобулины A и G; ГП1 — β2-гликопротеид I; ф — фибриноген (фактор I свертывающей системы крови); α2М — α2-макроглобулин ; β-ЛП +IgM — β-липопротеиды (липопротеиды низкой плотности) + иммуноглобулины М; ГпТ — гаптоглобин.

Для наблюдения за ходом электрофореза в геле в исследуемую смесь добавляют химически инертный в отношении разделяемых веществ низкомолекулярный краситель (см. Красители), молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и молекулы разделяемых веществ, но обладают электрофоретической подвижностью, которая несколько выше подвижности белковой фракции, продвигающейся первой. Такой краситель называют лидирующим. Чаще всего в щелочных и нейтральных буферных растворах используют бромфеноловый синий, в кислой среде — метиловый зеленый или пиронин. Когда окрашенная зона доходит до конца геля, электрофорез прекращают, после фиксации гель на определенное время погружают в р-р специфического красителя, после чего избыток красителя отмывают (рис. 4) Для выявления на электрофореграмме белков-ферментов иногда пользуются их каталитической активностью в отношении хромогенных субстратов. Широко применяется обнаружение электрофоретических зон по их радиоактивности (см. радиография).

Многие исследователи в качестве инертных носителей предпочитают гели в виде тонких пластин. Электрофорез в гелевой пластине делает более достоверным сравнение отдельных препаратов, позволяет проводить двухмерное разделение и др. Для анализа аминокислот, пептидов и сахаров (в виде их боратных комплексов) используют высоковольтный электрофорез на бумаге, в тонком слое силикагеля, ацетата целлюлозы и других красителей.

Разделение сложной смеси белков не всегда удается осуществить даже при использовании перечисленных выше приемов электрофореза. Поэтому в сложных случаях применяют так называемый двухмерный электрофорез, когда после первого электрофоретического фракционирования смеси белков каждую полосу используют как исходный препарат для электрофореза в перпендикулярном направлении по отношению к направлению первого разделения. В результате на второй пластине появляется большое число зон, соответствующих индивидуальным белкам (иногда их число достигает 2 тысячи).

Существуют методы, объединяющие, например, электрофорез и хроматографию (см.); иногда разделение смеси белков проводят в перпендикулярных направлениях, или в одном направлении белки разделяют электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а в перпендикулярном ему — с помощью изоэлектрического фокусирования (см.). Последний метод позволяет на одной гелевой пластине выявить до 7 тысяч индивидуальных белков. Вариантами электрофореза являются также электрофорез в градиенте значений pH и электрофорез в градиенте пористости геля, иммуноэлектрофорез, аффинный электрофорез, сочетающий в себе преимущества электрофореза и аффинной хроматографии, и др.

С помощью электрофореза белков определяют их первичную структуру, молекулярный вес, патогенность и наличие множественных форм. Для электрофореза клеток используют свободнопроточный электрофорез в его аналитических и препаративных вариантах. Так фракционируют бактериальные клетки, вирусы, а также лизосомы, митохондрии, комплексы Глльджи и другие клеточные органеллы. Молекулы нуклеиновых кислот отличаются от молекул белков сильным отрицательным зарядом. Фракционирование их смесей осуществляют за счет различий мол. веса нативных высокомолекулярных ДНК и РНК. Для электрофоретического фракционирования их низкомолекулярных фрагментов используют крупнопористые гели агарозы или гели полиакриламида с концентрацией от 5 до 20%, а также их смеси. Анализ фрагментов нуклеиновых кислот, полученных при расщеплении молекул ДНК нуклеазами и химическими агентами, дает возможность определить первичную структуру этих биополимеров, то есть структуру генов (см. Ген).

Рис. 5. Изоферментные спектры лактатдегидрогеназы (ЛДГ) сыворотки крови, полученные методом электрофореза: а - изоферментный спектр ЛДГ в норме; б — при остром инфаркте миокарда; в — при вирусном гепатите; «—» и «+» — катод и анод.

Метод электрофореза позволил обнаружить нормальный наследственный полиморфизм белков человека. Стали известны десятки вариантов гемоглобинов (см. Гемоглобин), глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и других белков. Были получены данные о множественных формах ферментов (см. Изоферменты), последовательно экспрессируемых в ходе онтогенеза и генетически независимых. В результате исследования крови, мочи, цереброспинальной жидкости электрофореза были выявлены изменения нормальной экспрессии генов, кодирующих синтез определенных белков при различных патологических состояниях (рис. 5).

С помощью электрофоретического анализа ферментов (см.) возможна диагностика, в том числе пренатальная, некоторых врожденных заболеваний.

При молекулярной патологии происходит изменение плотности относительного заряда на поверхности клеток, поэтому методом электрофореза можно, например, выявить и разделить субпопуляции B- и Т-лимфоцитов.

Начаты исследования по получению особо чистых препаратов (например, интерферона) методом электрофореза в условиях невесомости при космических полетах.

Лекарственный электрофорез

Лекарственный электрофорез (устаревший ионофорез, ионтофорез, ионотерапия, гальваноионотерапия, ионогальванизация) — метод электролечения, заключающийся в сочетанном воздействии на организм постоянного тока и вводимых с его помощью лекарственных веществ. В лечебную практику лекарственный электрофорез был введен с 1802 году, когда Росси (Rossi) впервые применил для воздействия на организм больного лекарственные вещества в сочетании с постоянным током (см. Гальванизация). Долгое время для лекарственного электрофореза использовали только постоянный непрерывный ток (гальванический). В настоящее время широко применяют диадинамические токи (см. Диадинамоэлектрофорез), синусоидальные модулированные (амплипульсфорез) и флюктуирующие (флюктуофорез) токи в выпрямленном режиме.

Принципиальной основой лекарственного электрофореза является теория электролитической диссоциации (см. Диссоциация в химии, Электролиз). Лекарственные вещества, способные диссоциировать в растворе на положительные (катионы) и отрицательные (анионы) ионы, направленно перемещаются в поле постоянного электрического тока и могут поступать в организм, преодолевая кожный барьер (см. Кожа). При этом с электродной прокладки вводятся лишь те ионы, которые имеют одноименный знак с электродом.

При электрофорезе основными путями проникновения лекарственных веществ в организм через кожу являются выводные протоки потовых и, в меньшей степени, сальных желез. Часть лекарственного вещества проникает в организм через межклеточные пространства и часть — через сами клетки (особенно при электрофоретическом введении лекарственных веществ через слизистую оболочку).

При электрофорезе лекарственные вещества проникают на небольшую глубину: сразу после процедуры они обнаруживаются в основном в эпидермисе и дерме, в небольшом количестве — в подкожной клетчатке. Отсюда введенные путем электрофореза лекарственные вещества поступают в лимфо- и кровоток и разносятся по всему организму, хотя преимущественно они накапливаются в тканях и органах области воздействия.

Электрофорез лекарственных веществ через кожу и слизистые оболочки количественно не подчиняется законам электролиза, так как живые ткани обладают электрокапиллярной активностью (см. Электроосмос) и барьерными свойствами (см. Барьерные функции). При электрофорезе в организм вводится всего от 1 до 10% вещества, находящегося в растворе (на прокладке). На количество вводимого путем электрофореза вещества существенно влияют физико-химические свойства самих лекарственных средств и свойства их растворов (степень диссоциации вещества, размеры, величина и знак заряда иона, возможность и степень его гидратации, используемый растворитель, концентрация и др.), условия проведения физиотерапевтической процедуры (плотность тока, длительность воздействия возраст пациента и др.), функциональное состояние организма в целом и кожи в особенности.

Лекарственное вещество, вводимое методом электрофореза может действовать на организм рефлекторным путем (так называемый понный рефлекс по Щербаку), гуморальным путем и кроме того, оказывать местное действие. Это зависит от типа и количества лекарственного вещества, методики и условий проведения процедуры, параметров физического фактора и др.

Электрический ток, используемый для электрофореза, вызывает в организме разнообразные физико-химические, метаболические и клеточно-тканевые реакции (см. Гальванизация, Диатермия, Диатермоэлектрофорез), на фоне которых действие вводимых с помощью электрофореза лекарственных веществ приобретает ряд особенностей и преимуществ по сравнению с обычными способами фармакотерапии (см.). Наибольшее практическое значение при лекарственном электрофорезе имеют следующие факторы:

  1. более длительное действие лекарственного средства и более медленное выведение его из организма благодаря, прежде всего, образованию в коже депо ионов, обладающих фармакологической активностью;
  2. возможность создания высокой локальной концентрации лекарственного вещества без насыщения им крови и других сред организма;
  3. меньшая вероятность возникновения побочных реакций;
  4. введение лекарственного вещества в наиболее фармакологически активной форме — в виде ионов;
  5. безболезненность введения лекарственных средств и отсутствие деформации тканей, возникающей при других способах фармакотерапии из-за введения растворителя.

Благодаря стимулирующему действию электрического тока отчетливое специфическое и выраженное терапевтическое действие вводимых путем электрофореза лекарственных веществ проявляется при таких концентрациях, которые при обычных способах фармакотерапии оказались бы малодейственными или неэффективными.

Назначение лекарственного электрофореза определяется, с одной стороны, благоприятным лечебным эффектом постоянного непрерывного тока или других видов электрического тока (см. Импульсные токи), а с другой стороны — показаниями к применению соответствующих лекарственных средств.

Лекарственный электрофорез нельзя применить в тех случаях, когда имеются объективные противопоказания к применению электролечения и соответствующих лекарственных средств, а также при их индивидуальной непереносимости.

Техника лекарственного электрофореза сводится к расположению на пути тока (между телом человека и электродами) раствора лекарственного вещества. В зависимости от способа нанесения лекарственного вещества и подведения тока различают несколько вариантов лекарственного электрофореза. Наиболее распространено электрофоретическое введение лекарственных веществ из растворов, которыми смачиваются специальные прокладки между телом пациента и электродом. Техника выполнения лекарственного электрофореза в этой модификации мало отличается от техники гальванизации (см.). Единственное отличие заключается в том, что электродную прокладку смачивают не водопроводной водой, как при гальванизации, а раствором лекарственного вещества. Этот раствор с помощью бюретки или другого дозирующего устройства количественно наносят на гидрофильную прокладку или, чаще, на специальную лекарственную прокладку, располагаемую при процедуре между кожей и защитной прокладкой. Лекарственные прокладки готовят из 1—2 слоев фильтровальной бумаги или 2—4 слоев марли. По форме и площади они должны соответствовать защитной прокладке. Раствором лекарственного вещества смачивают обычно одну прокладку, однако лекарственные вещества, диссоциирующие на ионы с противоположными зарядами, могут наноситься на обе (катодную и анодную) прокладки.

Раствор лекарственного вещества наносят на прокладку электрода (положительно заряженного — анода или отрицательно заряженного — катода), одноименного с подлежащим электрофоретическому введению ионом. При выборе полярности следует учитывать следующее: ионы всех металлов, местноанестезирующие средства, большинство алкалоидов, антибиотиков и сульфаниламидных препаратов имеют положительный заряд, поэтому при электрофорезе они должны вводиться с анода, а ионы всех металлоидов и кислотные радикалы приобретают в растворах отрицательный заряд и, следовательно, должны вводиться в организм с катодного электрода. Суммарный заряд амфотерных соединений (белки, аминокислоты и др.) зависит от их ионного состава и величины pH среды (см. Водородный показатель): при низких значениях pH заряд становится более положительным, при высоких — более отрицательным.

При так называемом ванночковом электрофорезе в ванночку (стеклянную, фаянсовую, пластмассовую) с вмонтированными электродами, заполненную раствором лекарственного вещества, погружают подлежащую воздействию обнаженную часть тела больного.

Полостной лекарственный электрофорез заключается в том, что перед введением электрода, соединенного с соответствующим полюсом аппарата для лекарственного электрофореза, в полость желудка, мочевого пузыря, прямой кишки, влагалища, носа вводят раствор лекарственного вещества.

В медицинской практике, особенно при лечении заболеваний бронхолегочной системы, получает распространение так называемый внутритканевой электрофорез. При этом после введения лекарственного вещества в организм одним из общепринятых способов (внутривенно, подкожно, внутримышечно, ингаляционным путем) проводят гальванизацию области патологического очага при перпендикулярном расположении электродов. Время проведения процедуры должно соответствовать времени достижения максимальной концентрации лекарственного вещества в крови.

При сочетанных способах лечения лекарственный электрофорез можно проводить одновременно с другим физиотерапевтическим воздействием. К таким сочетанным способам относятся ультразвук — электрофорез (электрофонофорез), дозированный вакуум — электрофорез (вакуум-электрофорез), индуктотермия — электрофорез (индуктотермоэлектрофорез), магнитное поле — электрофорез (магнитоэлектрофорез) и др. Сочетание лекарственного электрофореза с другими физиотерапевтическими воздействиями позволяет вводить в организм лекарственное вещество в большем количестве и на большую глубину, чем при одном электрофорезе, и потенцирует его действие.

Для лечебного электрофореза применяют лекарственные средства, относящиеся к самым различным группам. Нам более часто употребляют местноанестезирующие средства, витаминные, ферментные препараты, химиотерапевтические, сосудорасширяющие и сосудосуживающие средства, седативные средства, природные соединения и др. Лекарственные вещества, предназначенные для электрофоретического введения, должны быть чистыми, не содержать наполняющих и связующих соединений, по возможности их растворы надо готовить непосредственно перед применением. В качестве растворителя при приготовлении растворов для лекарственного электрофореза лучше всего использовать дистилированную воду. При плохой растворимости лекарственного вещества в воде в качестве растворителя можно применять спирт, димексид и другие полярные растворители, разрешенные ГФ. Приготовление лекарственных средств на изотоническом растворе натрия хлорида и других растворах электролитов (см.) является нежелательным, так как это резко уменьшает введение в организм лекарственного иона. При электрофорезе ферментов в качестве растворителей используют буферные растворы (см.).

Дозируют лекарственный электрофорез так же, как и гальванизацию: по длительности процедуры от 10 до 30 минут и плотности тока 0,03—0,08 ма/см2. Для детей и пожилых людей дозиметрические параметры уменьшают в зависимости от возраста на 25— 30%. На курс лечения назначают от 10—12 до 15—20 процедур, которые проводят ежедневно или через день.

Для лекарственного электрофореза применяют различные аппараты. Источниками гальванического тока (см. Гальванизация) и импульсных диадинамических токов являются аппарат Поток-1, АГН-32, АГП-33, СНИМ-1 Модель-717, Тонус-1 и Тонус-2, синусоидальных модулированных токов — аппараты Амплипульс-ЗТ. Амплипульс-4, флюктуирующих токов — аппарат АСБ-2.



Библиогр.: Бабский В. Г., Жуков М. Ю. и Юдович В. И. Математическая теория электрофореза, Применение к методам фракционирования биополимеров, Киев, 1983; Гааль Э., Медьеши Г. и Верецкси X. Электрофорез в разделении биологических макромолекул, пер. с англ., М., 198* Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот, Электрофорез и ультрацентрифугирование, 1981; Парфенов А. П. Элестрофорез лекарственных веществ, Л., 1973, ; Улащик В. С. Теория и практика лекарственного электрофореза, Минск, 1976, библиогр.; он же, Физикофармакологические методы лечения и профилактики, Минск, 1979; Cell electroptoresis in cancer and other clinical reearch, ed. by A. W. Preece a. P. Light, Amsterdam, 1981; Dunn M. Affinity electrophoresis, Lab. Pract., 33, p. 13, 1984; Electrophoresis’83, Advanced methods biochemical and clinical applications, ed. by H. Hlrai, B.— N. Y., 1984.



Популярные статьи

Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание

Поделиться: