СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (лат. serum сыворотка + греч. logos учение) — методы иммунологии, изучающие специфические свойства крови человека или животных с целью выявления антигенов или антител с помощью серологических реакций.

С. и. широко используются в медицине для лаб. диагностики инфекционных и паразитарных болезней, определения группы крови и тканевых антигенов, видовой принадлежности белка, распознавания аутоиммунных болезней, нек-рых видов патологии беременных, гормональных нарушений, реактивности организма к антибиотикам и изучения многих других вопросов. Установление диагноза с помощью С. и. называют серодиагностикой (серологической диагностикой).

Начало С. и. положено в конце прошлого столетия, после того как было установлено, что соединение антигена с антителом (см. Антиген — антитело реакция) сопровождается рядом доступных визуальному наблюдению феноменов — агглютинацией (см.), преципитацией (см.) или лизисом. Появилась возможность специфического распознавания антигенов (см.) или антител (см.), если один из этих компонентов известен.

В 1897 г. Ф. Видаль сообщил, что сыворотка крови больных брюшным тифом избирательно агглютинирует брюшнотифозные бактерии и поэтому эта реакция (см. Видаля реакция) может быть применена для лаб. диагностики брюшного тифа. В том же году было показано, что фильтраты культур чумных, брюшнотифозных и холерных бактерий при соединении с соответствующими иммунными сыворотками образуют хлопья, или преципитат.

Реакция преципитации оказалась пригодной для обнаружения любых белковых антигенов. В 1900—1901 гг. К. Ландштейнер нашел, что в эритроцитах людей имеются два различных антигена (А и В), а в сыворотках крови два агглютинина (а и Р), что способствовало применению реакции гемагглютинации для определения групп крови (см.).

Открытие Ж. Борде в 1898 г. комплемента (см.), в присутствии к-рого иммунные антиэритроцитар-ные сыворотки приобретали способность лизировать эритроциты, позволило разработать реакцию связывания комплемента (см.), широко используемую в инфекционной и неинфекционной иммунологии.

Начиная с 40-х гг. 20 в. в серологических исследованиях стали применять иммунохихмические методы, а именно метку антител флюорохромами (см. Иммунофлюоресценция), изотопами (см. Радиоиммунологический метод) или ферментами (см. Энзимиммунологический метод). Это способствовало значительному повышению чувствительности серол. реакций, т. е. возможности выявления минимальных количеств антигенов или антител. Серол. реакции различаются по способности выявлять отдельные виды антител. Реакция агглютинации, напр., хорошо выявляет IgM-антитела, но менее чувствительна для обнаружения IgG-антител. Реакции связывания комплемента и гемолиза (см.), к-рые требуют участия комплемента, не выявляют антитела, не присоединяющие комплемент, напр. IgA-антитела и IgE-антитела. В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против антигенных детерминант поверхности ви-риона, связанных с патогенностью (напр., белок gp 56 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей).

Основные типы серологических реакций

Реакции, основанные на феномене агглютинации

Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки — наиболее простая серол. реакция. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t° 37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инф. болезней; бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии (см. Райта реакция, Хаддлсона реакция), сыпного тифа (см.. Вейля — Феликса реакция).

Реакция агглютинации для определения группы крови и резус-фактора применяется в акушерской практике, при гемотрансфузиях и трансплантации тканей. Антитела против резус-фактора (см.) представляют собой неполные антитела, они не способны к прямой реакции с резус-положительными эритроцитами, поэтому для их обнаружения используют реакцию Кумбса (см. Кумбса реакция), основанную на выявлении неполных антител с помощью антиглобулиновых сывороток. К эритроцитам известной специфичности добавляют исследуемую сыворотку крови, а вслед за этим антиглобулиновую сыворотку против IgG (непрямая реакция Кумбса). Fab-фрагменты неполных антител исследуемой сыворотки крови присоединяются к эритроцитам, а к свободным Fc-фрагментам этих антител присоединяются антитела против IgG, и происходит агглютинация эритроцитов. Для диагностики гемолитической анемии используют прямую реакцию Кумбса, В организме таких больных эритроциты соединяются с циркулирующими в крови антителами против резус-фактора. Чтобы их выявить, к эритроцитам, взятым у больного, добавляют антитела против IgG. Появление агглютинации эритроцитов подтверждает диагноз болезни.

Реакция торможения гемагглютинации — РТГА (см. Гемагглютинация) — основана на феномене предотвращения (торможении) иммунной сывороткой гемагглютинации эритроцитов вирусами. Феномен вирусной гемагглютинации не является серол. реакцией и происходит в результате соединения вируса с рецепторами эритроцитов, однако РТГА представляет собой серологическую реакцию, ис-пользуехмую для выявления и титрования противовирусных антител. РТГА — основной метод серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители к-рых обладают гемагглютинирующими свойствами.

Реакция пассивной, или непрямой, гемагглютинаций, В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические хчатериалы (напр., частицы латекса), на поверхности к-рых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела (см. Бойдена реакция). Агглютинация их происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антите-лахми, называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами (см.) и используют для выявления антигенов:

Реакция пассивной гемагглютинации применяется для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.). Реакция пассивной гемагглютинации по чувствительности не уступает методу выделения вируса при ареновирусных болезнях (см.), в частности при лимфоцитарном хориоменингите. Вирусный антиген лимфоцитарного хориоменингита выявляется у вирусоносителей (домовых мышей) в реакции пассивной гемагглютинации с суспензиями извлеченных органов, разведенными в десятки тысяч раз. При сальмонеллезе в реакции пассивной гемагглютинации определяются бактерии при концентрации до нескольких сотен микробных тел в 1 г фекалий, дизентерийные бактерии в пищевых продуктах выявляются при содержании в 1 г материала не менее 500 микробных тел.

Реакция пассивной гемагглютинации используется в диагностике и профилактике вирусного гепатита В. В Советском Союзе для выявления HBs-антигена (см. Австралийский антиген) в крови больных с острым гепатитом В производится диагностикум, представляющий собой эритроциты кур, сенсибилизированные козьим иммуноглобулином против HBs-антигена. Каплю диагностику-ма соединяют с равным объемом сыворотки крови обследуемых людей, и, если в ней присутствует HBs-антиген, происходит агглютинация. Реакция способна уловить до 1,5 нг/мл HBs-антигена. Для обнаружения HBs-антител используют эритроциты с сорбированным на них HBs-антигеном, выделенным из крови больных. Реакцию пассивной гемагглютинации применяют также для выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, напр, пенициллину или инсулину. В этом случае эритроциты 0 группы крови человека сенсибилизируют лекарственным веществом и затем используют для выявления к нему агглютининов в сыворотке крови больного.

Реакцию пассивной гемагглютинации используют для выявления гонадотропного гормона в моче с целью установления беременности (см. Хорионический гонадотропин). Для этого стандартная сыворотка к этому гормону инкубируется с исследуемой мочой. При последующем добавлении эритроцитов с сорбированным на них гормоном агглютинация не наступает (положительный ответ), т. к. содержащийся в моче гормон нейтрализовал агглютинирующие антитела.

Реакции, основанные на феномене преципитации

Их используют для определения самых разнообразных антигенов и антител. Простейшим примером качественной реакции является образование непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело в пробирке. Широко применяются различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез), к-рые носят одновременно качественный и количественный характер (см. Иммунодиффузия, Иммуноэлектрофорез).

Для постановки двойной иммунодиффузии наливают слой растопленного геля на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают лунки диаметром 1,5—3 мм. В расположенные по кругу лунки помещают исследуемые антигены, а в центральную лунку — иммунную сыворотку известной специфичности. Диффундируя навстречу друг другу, гомологичные сыворотки и антигены образуют преципитат. При радиальной иммунодиффузии (по методу Ман-чини) иммунную сыворотку вносят в агар. Антиген, помещенный в лунки, диффундирует через агар, и в результате преципитации с иммунной сывороткой вокруг лунок образуются непрозрачные кольца, внешний диаметр к-рых пропорционален концентрации антигена. Модификацию этой реакции используют в диагностике гриппа для распознавания IgM- и IgG-антител (см. Иммуноглобулины). В агар вносят гриппозный антиген, а в лунки сыворотки крови. Затем пластины обрабатывают иммунными сыворотками против IgM- или IgG-антител, что способствует выявлению реакции соответствующих антител с антигенами. Метод позволяет одновременно определять титры антител и принадлежность их к определенному классу иммуноглобулинов.

Разновидностью иммуноэлектрофореза является радиоиммунофорез. В этом случае после электрофоретического разделения антигенов в канавку, вырезанную параллельно движению антигенов в геле, наливают сначала меченную радиоактивным йодом иммунную сыворотку против определяемых антигенов, а затем иммунную сыворотку против IgG-антител, к-рая преципитирует образовавшиеся комплексы антитела с антигеном. Все несвязавшиеся реагенты вымывают, а комплекс антиген — антитело обнаруживают методом авторадиографии (см.).

Реакции с участием комплемента. Реакции с участием комплемента (см.) основаны на способности субкомпонента комплемента Cl(Clq) и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам.

Реакция связывания комплемента позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген — антитело. Эта реакция состоит из двух фаз: взаимодействия антигена с испытуемой сывороткой крови (исследуемая система) и взаимодействия гемолитической сыворотки с бараньими эритроцитами (индикаторная система). При положительной реакции в исследуемой системе происходит связывание комплемента, и тогда при добавлении сенсибилизированных антителами эритроцитов не наблюдается гемолиза (см. Реакция связывания комплемента). Реакция широко применяется для серодиагностики висцерального сифилиса (см. Вассермана реакция) и вирусных инфекций (см. Вирусологические исследования).

Цитолиз. Антитела против клеточных структур могут при участии комплемента растворять клетки, несущие эти структуры. Лизис эритроцитов легко оценивать по степени и интенсивности освобождения гемоглобина. Лизис нуклеарных клеток оценивают путем подсчета процента мертвых клеток, к-рые не окрашиваются метиленовым синим. Часто также используют ^радиоак-тивный хром, к-рый предварительно химически связывают с клетками. Число разрушенных клеток определяют по количеству несвязанного хрома, освобождающегося при лизисе клеток.

Реакция радиального гемолиза эритроцитов может протекать в геле. Взвесь эритроцитов барана шшещают в агарозный гель, добавив туда комплемент; в застывшем на стекле слое делают лунки и вносят в них гемолитическую сыворотку. Вокруг лунок в результате радиальной диффузии антител будет образовываться зона гемолиза. Радиус зоны гемолиза прямо пропорционален титру сыворотки. Если сорбировать на эритроцитах какой-либо антиген, напр, гликопротеиновый гемагглю-тинин вируса гриппа, краснухи или клещевого энцефалита, то можно воспроизвести феномен гемолиза иммунными сыворотками к этим вирусам. Реакция радиального гемолиза в геле нашла применение в диагностике вирусных инфекций благодаря простоте постановки, нечувствительности к сывороточным ингибиторам, возможности титровать сыворотки крови по диаметру зоны гемолиза, не прибегая к серийным разведениям.

Иммунное прилипание. Эритроциты, тромбоциты и другие клетки крови имеют на поверхности рецепторы к третьему компоненту комплемента (СЗ). Если к антигену (бактерии, вирусы и др.) добавить соответствующую иммунную сыворотку и комплемент, то образуется комплекс антиген — антитело, покрытый СЗ-компонентом комплемента. При смешивании с тромбоцитами благодаря СЗ-компоненту комплемента комплекс антиген — антитело осядет на клетках и вызовет их агглютинацию (см. Иммунное прилипание). Эта реакция применяется для определения антигенов системы HLA (см. Иммунитет трансплантационный) и при изучении ряда вирусных -инфекций (клещевой энцефалит, лихорадка денге), к-рые сопровождаются имму-нопатол. процессами и циркуляцией в крови вирусных антигенов в комплексе с антителами.

Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать нек-рые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, напр, активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. В бактериологии эта реакция используется для обнаружения антистрептолизи-нов, антистрептокиназы и антистафилолизинов. Реакцию нейтрализации токсинов можно оценивать по биол. эффекту, так, напр., титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки (см. Токсин — антитоксин реакция). Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, предотвращает их гибель. Различные варианты реакции нейтрализации применяют в вирусологии. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры патогенность вирусов нейтрализуется.

Реакции с использованием химических и физических меток

Иммунофлюоресценция, разработанная Кунсом (А. Н. Coons) в 1942 г., заключается в использовании для серол. реакций меченных флюорохромом сывороток (см. Иммунофлюоресценция). Меченная флюорохромом сыворотка образует с антигеном комплекс антиген — антитело, к-рый становится доступным наблюдению под микроскопом в ультрафиолетовых лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках. Так, для диагностики бешенства отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоноситель-ство, обрабатывают люминесцирую-щей антирабической сывороткой. При положительном результате в протоплазме нервных клеток наблюдаются глыбки ярко-зеленого цвета. На обнаружении антигенов вирусов в клетках отпечатков со слизистой оболочки носа основана экспресс-диагностика гриппа, парагриппа и аденовирусной инфекции.

Более широко применяется метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на выявлении комплекса антиген — антитело с помощью люминесцирующей иммунной сыворотки против IgG-антител и используемый для обнаружения не только антигенов, но и титрования антител. Метод нашел применение в серодиагностике герпеса, цитомегалип, лихорадки Ласса. В лаборатории должен храниться при г°—20° запас препаратов антигенсодержащих клеток, напр, выращенные на кусочках тонкого стекла и зараженные вирусом клетки VERO или куриные фибробласты, зафиксированные ацетоном. На препараты наслаивают исследуемую сыворотку крови, помещают препарат в термостат при f 37° для образования иммунных комплексов, а затем после отмывания несвязавшихся реагентов выявляют эти комплексы меченой люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека. Применяя меченые иммунные сыворотки против IgM-или IgG-антител, можно дифференцировать тип антител и обнаруживать ранний иммунный ответ по наличию IgM-антитед.

Иммунофлюоресценция широко используется не только в бактериологии, вирусологии, паразитологии, но и в иммунопатологии (см.) для обнаружения гуморальных антител к тканевым антигенам человека: митохондриям, гладкой мускулатуре, клеткам желудка.

В энзим - иммунологическом методе применяют антитела, конъюгированные с ферментами, гл. обр. пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Чтобы обнаружить соединение меченой сыворотки с антигеном, добавляют субстрат, разлагающийся присоединенным к сыворотке ферментом с появлением окрашивания в желто-коричне-вый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфатаза) цвет. Используют также ферменты, разлагающие не только хромогенный, но и люмогенный субстрат. В этом случае при положительной реакции появляется свечение. Подобно иммунофлюоресценции, энзимиммунологический метод применяют для обнаружения антигенов в клетках или титрования антител на антигенсодержащих клетках.

Наиболее популярной разновидностью энзим-иммунологического метода является иммуносорбция. На твердом носителе, к-рым могут быть целлюлоза, полиакриламид, дек-стран и различные пластмассы, сорбируют антиген. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. В лунки с сорбированным антигеном вносят исследуемую сыворотку крови, затем меченную ферментом антисыворотку и субстрат. Положительные результаты учитывают по изменению цвета жидкой среды. Для обнаружения антигенов на носитель сорбируют антитела, затем вносят в лунки исследуемый материал и проявляют реакцию меченной ферментом антимикробной сывороткой.

Радиоиммунологически й метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Первоначально он был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. Тест-системой являлся меченный изотопом гормон (антиген) и антисыворотка к нему. Если к такой антисыворотке добавить материал, содержащий искомый гормон, то он свяжет часть антител, при последующем внесении меченого титрованного гормона с антителами свяжется уменьшенное по сравнению с контролем его количество. Результат оценивают по сопоставлению кривых связанной и несвязанной радиоактивной метки. Эта разновидность метода носит название конкурентной реакции. Существуют и другие модификации радиоиммунологического метода. Радиоиммунологический метод — наиболее чувствительный метод определения антигенов и антител, используемый для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиоз-ных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов.

Сравнительная характеристика и использование методов серологических исследований в медицинской практике

Методы С. и. непрерывно совершенствуются в направлении повышения чувствительности и универсальности использования. Изначально серол. диагностика основывалась на выявлении антител. С появлением в середине 20 в. реакций иммунофлюоресценции и пассивной ге-магглютинации, обладающих большей чувствительностью, появилась возможность обнаруживать не только антитела, но и антиген непосредственно в материале от больных. Эн-зим-иммунологический и радиоиммунологический методы, по чувствительности на 2—3 порядка превышающие иммунофлюоресценцию и пассив-нуюгемагглютинацию, приближаются к методам биол. обнаружения бактерий и вирусов. Область их применения для обнаружения как антигенов, так и антител теоретически не ограничена.

Серодиагностика инф. болезней базируется на появлении антител к выделенному или предполагаемому возбудителю независимо от того, был ли обнаружен возбудитель в острой стадии болезни. Исследуют пары сывороток крови, взятых в начале болезни и 2—3 нед. спустя. Прирост антител во второй сыворотке крови не менее чем в 4 раза по сравнению с первой является диагностически значимым. Имеет также значение, каким классом иммуноглобулинов представлены антитела. IgM-антитела обнаруживают в конце острого периода болезни и в ранней стадии реконвалесценции. IgG-антитела появляются в более поздние сроки реконвалесценции и циркулируют долго. Если у женщины в первом триместре беременности обнаруживают IgM-антитела к вирусу краснухи, то это служит основанием для прерывания беременности, т. к. в этот период плод особенно чувствителен к вирусу. При разных инф. болезнях избирательно используют наиболее специфические и удобные в исполнении методы.

С. и. широко применяют в эпидемиологии. Систематический сбор и исследование образцов крови различных групп населения позволяют уяснить контакты населения с источником возбудителей инф. болезней. Изучение уровня коллективного иммунитета позволяет выявлять группы повышенного риска и планировать прививочные мероприятия, изучать географическое распространение инфекций. С. и. различных возрастных групп населения позволили, напр., ретроспективно выявить циркуляцию разных вариантов вируса гриппа в определенные периоды времени.

С. и. имеют большое значение в изучении наследственных болезней (см.) и аутоиммунных болезней, сопровождающихся появлением ткане- и органоспецифических антител, разрушающих соответствующие клетки-мишени, а также в онкологии для обнаружения опухолевых антигенов. Так, иммунодиагностика рака печени основана на определении в сыворотке крови больных альфа-фетопротеина и других эмбриональных антигенов методом иммунодиффузии и радиоиммунологическим методом.

Значительный прогресс науки в изучении тонкой антигенной структуры клеточных антигенов, антигенов бактерий и вирусов достигается благодаря применению в серол. реакциях моноклональных антител, к-рые можно получать к отдельным детерминантам антигена.

См. также И ммунодиагностика.



Библиогр.: Методы исследований в иммунологии, под ред. И. Лефковитса и Б. Пер-ниса, пер. с англ., М., 1981; Руководство по иммунологии, под ред. О. Е. Вязова и Ш. X. Ходжаева, М., 1973; Руководство по клинической лабораторной диагностике, под ред. В. В. Меньшикова, М., 1982; Immunology, ed. by J.-F. Bach, N. Y., 1978.



Популярные статьи

Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание

Поделиться: