КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ — клетки, кусочки ткани, зачатки органа, растущие или сохраняющие жизнеспособность вне организма «в пробирке» (in vitro).

В клеточных культурах клетки не организованы в ткань, тогда как для тканевых и органных культур необходимым условием является сохранение тканевой и органотипической дифференцировки и (или) функции.

История

Первые попытки культивирования клеток in vitro были сделаны в 19 в. В 1885 г. Ру (W. Roux) удалось в течение нескольких дней поддерживать развитие медуллярной пластинки куриного эмбриона в солевом р-ре, а в 1887 г. Арнольду (J. Arnold) — наблюдать миграцию лейкоцитов лягушки. Однако в это время не было реальной базы для создания условий, способных поддерживать жизнедеятельность клеток и тканей in vitro. Подлинным началом культивирования клеток вне организма считаются опыты Гаррисона (R. G. Harrison), который в 1907 г. эксплантировал в сгустках лимфы лягушки кусочки медуллярной трубки эмбриона лягушки. Через несколько недель культивирования у этих клеток вырастали аксоны. Метод культивирования в сгустке лимфы, позднее в сгустке плазмы, с добавлением эмбриональных экстрактов стал одним из общепринятых и используется до наст, времени.

Развитию методов культивирования во многом способствовали исследования А. Карреля, который показал возможность длительного культивирования клеток в условиях строгой асептики. Флаконы Карреля являются необходимым элементом оборудования современных культуральных лабораторий. Большой вклад в разработку методов культивирования клеток внесли отечественные ученые А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Г. К. Хрущов, Н. Г. Хлопин и А. Д. Тимофеевский. Группа исследователей из Национального ракового ин-та (США) под руководством Эрла (W. Earle) разработала методы культивирования клеток на стекле, получила культуры одиночных клеток и клеток в суспензии. Результатом работ Фишера (D. Fischer, 1948), Мортона, Паркера, Моргана (Н. J. Morton, R. Parker, J. F. Morgan, 1950), Игла (H. Eagle, 1955) явилось создание современных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих in vitro.

После того как в 50-х гг. 20 в. была показана возможность размножения вируса полиомиелита на ряде клеточных культур и возникла практическая заинтересованность в разработке методов К. к. и т., для получения вакцин эта область исследований начала стремительно развиваться. Создание специальных сред культивирования позволило получить культуры клеток из разных органов и тканей многих видов млекопитающих и человека (см. таблицу). Были выведены специальные суспензионные культуры, приближающиеся по своим способностям давать большую биомассу к культурам микроорганизмов. Суспензионные культуры нашли применение в вирусологии для накопления вирусов энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита, везикулярного стоматита, осповакцины, гриппа, болезни Ньюкасла, а также в производстве биол, активных препаратов: ферментов, антител, вакцин. Различные Культуры клеток и тканей применяются с диагностическими целями для культивирования вирусов (см.).

Обнаружение явления спонтанной злокачественной трансформации клеток in vitro, а также трансформации с помощью ряда вирусов и химических канцерогенов явилось экспериментальной основой изучения механизмов канцерогенеза (см. Онкогенез). Разработаны методы слияния клеток для образования гибридов соматических клеток (см. Генетика соматических клеток), которые используются для картирования генов млекопитающих. Совершенствование методов культивирования клеток явилось основой развития цитогенетики человека, идентификации синдромов, связанных с нарушением числа и структуры хромосом (синдромы Дауна, Шерешевского — Тернера, Клайнфелтера, Эдвардса, Патау, кошачьего крика и т. д.). Успехи в области цитогенетики и картирования генов связаны с разработкой принципиально новых методов дифференциальной окраски хромосом. Совершенствование методов культивирования амниотических клеток плода и техники амниоцентеза (см.) позволило подойти к решению основных вопросов медико-генетического консультирования — пренатальной диагностике хромосомных заболеваний и наследственных биохим, нарушений обмена.

Культура клеток является одной из экспериментальных моделей генной инженерии (см.).

Кроме того, методы К. к. и т. применяются в гистологии для изучения морфогенеза и функц, анатомии клеток и тканей, в иммунологии для культивирования иммунокомпетентных клеток (см.) и изучения их функций в гематологии для культивирования клеток костного мозга и периферической крови.

Основные условия культивирования клеток и тканей

Для производства, получения и хранения Культур клеток и тканей необходимы стерильные помещения, широкий ассортимент солевых р-ров, питательных сред и антибиотиков. Кроме того, требуется следующее оборудование: стерильные боксы с ультрафиолетовым облучением и установками с ламинарным потоком стерильного воздуха; микроскопы — инвертированные для просмотра культур и обычные для анализа препаратов; центрифуги; термостаты с водяным обогревом и с контролируемой подачей CO2; рефрижераторы для хранения сред, антибиотиков, сывороток, ферментов; установки для замораживания и емкости с жидким азотом для хранения клеточных линий; магнитные мешалки; резиновые пробки, трубки, наконечники; посуда из нейтрального стекла типа «Пирекс». Посуду кипятят в специальных детергентах, многократно прополаскивают дист, водой, стерилизуют сухим жаром или автоклавированием. Используемые биол, жидкости стерилизуют фильтрованием под давлением через мембранные фильтры с размером пор 220 нм после предфильтрования через глубинные фильтры (из асбеста или стеклянного волокна).

Кроме традиционного оборудования, современная культуральная лаборатория использует микрополичашки (пластиковые панели с углублениями) с набором автоматических микропипеток и микродозиметров, роллерные и суспензионные установки. Желательно применение пластиковой посуды одноразового пользования.

При поддержании жизнедеятельности клеток in vitro важное значение имеют осмотическое давление, концентрация ионов водорода (pH) и ряд других неорганических ионов, состав газовой среды, температура. Осмотическое давление в клетках млекопитающих составляет при t° 38° ок. 7,6 атм, и его необходимо поддерживать в культуральной среде. Осмотическое давление в питательных средах создается гл. обр. концентрацией хлорида натрия. Определенную роль играют другие неорганические ионы и глюкоза. Высокомолекулярные соединения мало влияют на величину осмотического давления.

Оптимальная концентрация ионов водорода, т. е. pH среды, для роста большинства клеток близка к нейтральным значениям. Для роста диплоидных фибробластов необходимо поддерживать pH в пределах 7,2 — 7,4. Большинство клеток, особенно постоянные клеточные линии, т. е. пересеваемые линии, выдерживают pH от 6,8 до 7,6. Величина pH в культуральной среде зависит от соотношения Гидрокарбонат натрия является частью сбалансированного солевого р-ра питательной среды, CO2 образуется в результате дыхания клеток. При культивировании в закрытых сосудах, в случае низкой начальной концентрации клеток, уровень pH сдвигается резко в щелочную сторону, что сказывается на жизнеспособности клеток. Этого можно избежать, вдувая во флаконы CO2 сразу после посева. Предпочтительно культивирование в открытых сосудах, в термостатах с контролируемой подачей CO2 (5 — 10% CO2 и 95—90% воздуха). Производятся среды с большой буферной емкостью на основе фосфатного буфера, Tris или HEPES (оксиметил-аминометан и N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-этансульфоновая к-та).

Для постоянного контроля за уровнем pH в состав ростовых сред вводят индикатор pH, в качестве к-рого часто применяют фенол-красный или фенол-сульфонталеин. Эти вещества не токсичны для клеток в концентрации до 0,002 г/л.

Для поддержания жизнедеятельности клеток и тканей in vitro необходимы ионы натрия, кальция, магния, железа, которые не только участвуют в поддержании постоянства осмотического давления, но необходимы для функционирования ряда клеточных ферментов. Существенна также и достаточная концентрация кислорода, к-рая в закрытых сосудах обеспечивается определенными отношениями объема воздуха и объема среды.

Питательные среды

Культивирование К. к. и т. обеспечивается в первую очередь сложным сбалансированным набором ряда питательных компонентов среды. Среды делятся на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды обеспечивают рост клеток и тканей, тогда как поддерживающие предназначены гл. обр. для сохранения жизнеспособности и функц, активности К. к. и т. в течение продолжительного времени. Среди ростовых сред, в свою очередь, можно выделить естественные питательные среды — продукты частичной обработки естественных высокопитательных веществ: инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота, лошади, человека, эмбрионов телят; гидро-лизат лактальбумина — продукт ферментативного гидролиза белков молока; аминопептид — ферментативный гидролизат белка; гемогидролизат — продукт ферментативного расщепления крови крупного рогатого скота и человека; эмбриональный куриный экстракт. Существенным недостатком всех естественных (нативных) питательных сред является их нестандартность и сложность стерилизации. Синтетические питательные среды готовят из определенных хим. веществ без включения естественных продуктов.

На синтетических средах без добавления сыворотки или других естественных питательных веществ растут не все клетки. Наиболее широко применяются среда 199, среда Игла и ее модификации, среда F-10 и F-12 (Хэма), CMRL-1066, NCTC-109, среда Мак-Коя и др. В состав синтетических питательных сред входят, как правило, незаменимые аминокислоты в L-форме (аргинин, гистидин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин). Необходимы также цистеин и тирозин. У трансформированных клеток резко повышена потребность в глутамине. Для улучшения роста единичных клеток необходимо добавлять серин. Комплекс витаминов включает витамины группы В (парааминобензойная к-та, биотин, холин, фолиевая к-та, никотиновая к-та, пантотеновая к-та, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин, инозитол). Некоторые среды (среда 199, NCTC-109) содержат коферменты и жирорастворимые витамины. Важную группу компонентов составляют восстановители (аскорбиновая к-та, L-цистеин, глутатион) и предшественники нуклеиновых к-т. Источником углеводов служат глюкоза, 2-дезокси-D-рибоза, D-рибоза. Состав сред постоянно совершенствуется. Добавление сыворотки к синтетическим средам улучшает рост клеток. Широкое применение имеют синтетические среды с добавлением 5—20% сыворотки. Для клеточных культур используют сыворотку различного происхождения. H аи лучшими ростовыми свойствами обладает эмбриональная сыворотка. Полностью роль всех компонентов сыворотки не выяснена. Пептиды, липиды, аминокислоты являются источниками питательных веществ. Высокомолекулярные фракции сыворотки альфа- и бета-глобулины выполняют защитную функцию, предохраняя клетки от повреждения. Сыворотка способствует прикреплению клеток к субстрату и распластыванию на нем.

Поддерживающая среда, как правило, ростовая среда, в к-рую не входит сыворотка. Созданы специальные поддерживающие среды, включающие желатину или снятое молоко.

Для приготовления рабочих р-ров и сред используют бидистиллированную или деминерализованную с помощью ионообменников воду. Многие первичные культуры хорошо растут на среде, содержащей гидро-лизат лактальбумина или гемогидролизат и сыворотку. Хорошие результаты дает среда F-10 (Хэма) с 2 — 10% сыворотки. Для выращивания постоянных клеточных линий используют основную среду Игла или среду 199 с добавлением 10% сыворотки, часто используют минимальную среду Игла (МЭМ). При работе с клеточными линиями повышенной питательной потребности рекомендуются среды Мак-Коя, Дульбекко и др. Клетки млекопитающих легко адаптируются к разным средам, однако наблюдаются случаи сложной адаптации и токсичности сред. Как правило, указанные случаи связаны с нарушением стандартных условий в производстве сред или сыворотки.

Контаминация культур клеток микроорганизмами и использование антибиотиков

Несмотря на соблюдение правил стерильности, в лабораториях, работающих с клеточными культурами, бывают случаи бактериальной, микоплазменной, грибковой и вирусной контаминации клеточных культур. Источником контаминации бактериями и микоплазма-ми могут быть исследователи, сыворотка и воздух. Вирусы могут попасть в культуру с клетками, если они взяты из инфицированного организма, а также с трипсином или сывороткой. Основой подбора антибиотиков, обладающих способностью убивать микроорганизмы, являются результаты бактериол, анализа загрязнений и тестирования эффективности действия на них антибиотиков. Наиболее часто для борьбы с бактериальными загрязнениями используют пенициллин, стрептомицин, неомицин, линкамицин, гентамицин, полимиксин, для борьбы с микоплазмами — канамицин, миокризин, ауреомицин и тилозин, а с грибками — фунгизон (амфотерицин В).

Методы приготовления и характеристика культур клеток и тканей

Культуры переживающих тканей

Как правило, для кратковременного поддержания жизни клеток и тканей используют сбалансированные солевые р-ры с определенным осмотическим давлением и pH среды. В качестве источника энергии добавляют глюкозу. Для поддержания переживающих культур наиболее широко пользуются р-рами Ханкса, Эрла, Тирода, Дульбекко и средой Троуэлла—Т8.

Культуры растущих тканей

Получение культур тканей основано на первичной эксплантации растущих тканей, изолированных непосредственно из организма. К основной группе методов относятся те, в которых используются предметные стекла с лунками, флаконы Карреля, а также пробирки и перфузионные камеры.

Эксплантацию небольших кусочков ткани для морфол, исследований в сочетании с микрокиносъемкой проводят на предметном стекле, к-рое потом накрывают специальным покровным стеклом и заклеивают. Более известны модификации этого метода: эксплантация на одинарное покровное стекло со сгустком плазмы, к-рое помещают над лункой предметного стекла (Гаррисон); метод Максимова с двойным покровным стеклом; метод культивирования в капле среды на покровном стекле [Льюис и Льюис (W. Lewis, М. Lewis)]. Методы культивирования К. к. и т. на стеклах удобны для кратковременных исследований, т. к. длительное ведение связано с необходимостью сложной замены питательной среды. Культуры на покровных стеклах можно пересевать. Для этого эксплантат рассекают на кусочки и переносят на новые покровные стекла. Каждый кусочек обрабатывают затем, как новый эксплантат.

Более длительное культивирование эксплантатов возможно в сгустке плазмы во флаконах Карреля [Эрл (W. R. Earle)]. Метод используют при формировании линий и штаммов клеток. Для этой цели во флаконы Карреля помещают каплю смеси плазмы и эмбрионального экстракта, к-рую распределяют по дну флакона, помещают кусочки ткани в плазму и дают образоваться сгустку, а затем приливают питательную среду. Ткань можно переносить из сосуда в сосуд, нарезая кусочками или трипсинизируя ткань и сгусток, как в случае получения первично трипсинизированных культур.

Культивирование в сгустке плазмы в неподвижной или вращающейся пробирке, метод «летающих стекол» близки к культивированию во флаконах Карреля. Эксплантаты можно укреплять на стенках пробирки или на узких покровных стеклах, которые помещают в пробирки с питательной средой. Пробирки можно поместить в наклонном положении во вращающийся барабан для лучшего контакта эксплантата со средой. Метод «летающих стекол» получил широкое применение для исследования большого числа эксплантатов. Вместо сгустка плазмы можно использовать подложки: коллагеновые, лавсановые (для дальнейших электронно-микроскопических исследований), пластиковые, агаровые, из пористой бумаги, ацетатцеллюлозы. Можно эксплантировать ткань и непосредственно на стекле, в частности при эксплантации кусочков кожи, макрофагов и других клеток, способных прикрепляться к стеклу. Задачей метода органных культур является создание условий культивирования, максимально близких к условиям in vivo. Основной принцип метода состоит в том, что эксплантат помещают на границе двух фаз —питательная среда/газовая смесь. Существует несколько вариантов поддержания органных культур: культивирование на поверхности плазменного сгустка, на часовом стекле в чашке Петри [Фелл (Н. Fell)] — классическая техника, являющаяся основой современных методов; культивирование в мягком (полутвердом) агаре, насыщенном питательной средой, эмбриональным экстрактом, сывороткой; культивирование на металлических (тантал или нержавеющая сталь) сетках, покрытых агаром [Троуэлл (О. Trowell)], нижняя поверхность которых касается жидкой питательной среды; культивирование на «плоту» из ацетатцеллюлозы или папиросной бумаги [Чан (J. Chan), 1954; Рихтер (Richter), 1955]; культивирование на миллипоровых фильтрах [Гробштейн (С. Grobstein), 1955]. Для создания оптимальных условий культуры инкубируют в газовой смеси, состоящей из 95% O2 и 5% CO2 с ежедневной сменой питательной среды. Широкое распространение в технике тканевых и органных культур имеют перфузионные камеры, позволяющие прижизненно изучать процессы развития.

Первичные культуры, диплоидные штаммы и клеточные линии

Независимо от отношения к субстрату следует различать первичные культуры и клеточные линии. Первичные культуры получают непосредственно из нормальных или опухолевых тканей человека или животных методом эксплантации или трипсинизации тканей, обладающих ростовыми потенциями (эмбриональные: костно-мышечная ткань, амнион, легкое и т. д.; взрослые: кожа, почечная паренхима и т. д.). При этом чаще всего получают культуры эпителиальных клеток или фибробластов.

Культура считается первичной, пока она не подверглась хотя бы однократному пассированию. В процессе пассирования первичные культуры превращаются в клеточные линии.

Клеточные линии могут быть либо кратковременными, т. е. способными проходить ограниченное число пассажей, либо постоянными (пересеваемыми, перевиваемыми, стабильными, трансформированными), т. е. способными к неограниченному пассированию in vitro.

Рис. 1. Однослойная (монослойная) культура клеток: на всем поле зрения видны клетки китайского хомячка, растущие на стекле; х 300.

Общим для современных способов получения первичных трипсинизированных однослойных культур является обработка тканей трипсином, реже химотрипсином, папаином, панкреатином, гиалуронидазой, коллагеназой. В стерильных условиях ткань измельчают, промывают и помещают в р-ре фермента на магнитную мешалку. Полученную суспензию клеток центрифугируют, осадок клеток разводят ростовой средой до оптимальной концентрации (в зависимости от типа клеточных культур от 100 000 до 500 000 клеток на 1 мл среды). После посева в культуральные флаконы клетки прикрепляются к стеклу и адаптируются к условиям in vitro (фаза стабилизации, lag-фаза), затем они начинают активно пролиферировать (фаза логарифмического роста, log-фаза), вступая в стационарную фазу с образованием монослоя (рис. 1).

Разновидностью монослойных культур являются роллерные культуры. Роллерное культивирование клеток позволяет использовать всю внутреннюю поверхность флакона, к-рая омывается средой в результате постоянного вращения флакона с низкой скоростью (0,5—1 об/мин). Чередование жидкой и воздушных фаз, омывающих клетки, создает максимально благоприятные условия для роста клеток и повышает их продуктивность. Роллерное культивирование применимо для первичных культур, диплоидных штаммов, клеток, а также постоянных клеточных линий с выраженными адгезивными свойствами клеточной поверхности. Успех культивирования на роллерах зависит также от состава среды. Наиболее эффективны установки с перфузией среды во вращающихся роллерах.

Существуют количественные методы оценки пролиферативной активности клеток в культуре. Митотическая активность характеризуется числом клеток, находящихся в разных фазах митоза, на 1000 сосчитанных. Значения выражают в промилле. В зависимости от типа клеточных культур и условий культивирования эта величина варьирует. Наибольших значений митотическая активность достигает в фазе логарифмического роста. Благодаря существованию у нормальных клеток феномена контактного ингибирования роста (см.) формирование сплошного монослоя ведет к прекращению клеточной пролиферации. Для получения новых клеточных генераций сформированный монослой трипсинизируют до образования единичных клеток, которые разводят ростовой средой и пересеивают в новые флаконы. Число пассажей у первичных культур ограничено, и по прошествии определенного времени в них развиваются явления неспецифической дегенерации, ведущей к гибели клеток. Смена среды, создание оптимальных условий культивирования не предотвращают этого процесса.

Рис. 2. Клон клеток китайского хомячка, растущий в мягком агаре вследствие меньшего сродства к субстрату; х 200.
Рис. 3. Микропрепарат клеток, полученных в результате нескольких митотических делений одной клетки — клон; х 250.

Отдельные клетки в первичных культурах могут давать начало линиям измененных клеток, которые обладают потенцией безграничного роста в культуре. Выведение линий клеток из первичных культур длится в течение нескольких месяцев. Постоянные клеточные линии (рис. 2) характеризуются наследуемыми изменениями клеточной поверхности, которые в целом определяют их большую автономность, меньшее сродство к субстрату по сравнению с исходными клетками первичных культур. В ряде случаев трансформированные клетки утрачивают свойство контактного ингибирования роста, что в свою очередь ведет к формированию фокусов многослойного роста. Клетки клеточных линий имеют, как правило, нестабильный гетероплоидный набор хромосом. Совокупность всех этих особенностей наряду со свойством бесконечного размножения in vitro называют трансформацией. Можноиндуцировать трансформацию клеток с помощью некоторых вирусов и хим. соединений. Другим источником получения постоянных клеточных линий служат злокачественные новообразования (напр., HeLa-линия получена от женщины с плоско-клеточной карциномой шейки матки). Однако не из всех злокачественных новообразований удается получить клеточные линии. Использование метода клонирования клеток позволяет получить генетически однородную линию — клон, являющийся потомством одной клетки (рис. 3).

Из первичных культур нормальных тканей можно выделить диплоидные штаммы клеток, которые являются морфологически однородными культурами. Диплоидные штаммы должны сохранять в процессе пассирования диплоидный набор хромосом, характерный для особи, от к-рой получен штамм. Диплоидные штаммы проходят три фазы развития: стабилизации, активного роста и старения; они имеют продолжительный, но ограниченный срок жизни. Широко известен штамм WI-38 диплоидных клеток легкого эмбриона человека, выведенный Хейфликом и Мурхедом (L. Hayflick, P. S. Moorhead, 1961). Диплоидные штаммы получают методом эксплантации кусочков эмбриональной ткани и посевом взвеси эмбриональных клеток, щадяще обработанных трипсином при t° 4°. Важна исходная посевная концентрация — 10 5 клеток на 1 мл среды и pH 7,2—7,4. Очень важно получение однородной суспензии, т. к. не полностью трипсинизированные кусочки являются причиной раннего старения культуры. Диплоидные штаммы клеток эмбриона человека выдерживают ок. 50 пассажей. Штаммы, полученные из тканей взрослого организма, имеют более низкий пассажный потенциал. Культуры диплоидных клеток человека используют для приготовления следующих вирусных вакцин: полиомиелитной, аденовирусной, коревой, краснушной, оспенной, риновирусной, антирабической, против клещевого энцефалита. Критериями пригодности штаммов диплоидных клеток для производства вакцин являются кариологическая стабильность, отсутствие вирусной, бактериальной, микоплазменной и других контаминаций, отсутствие туморогенной активности при прививке животным. Для использования в практике получения вакцин штаммы на первых пассажах фазы активного роста замораживают и консервируют при температуре жидкого азота.

Кроме использования в вирусологии, диплоидные штаммы клеток широко применяют для изучения действия различных повреждающих агентов на генетический аппарат клетки для исследования ферментных систем клетки, в экспериментах по клеточной гибридизации, для изучения процессов индуцированной трансформации.

Суспензионное культивирование

Метод суспензионного культивирования дает возможность получать большое количество клеток, в частности для производства ферментов и других биологически активных соединений, имеющих научную и практическую ценность.

Метод суспензионного культивирования основан на изменениях свойств клеточной поверхности пересеваемых клеток, которые имеют пониженное сродство к субстрату. При суспензионном культивировании достигается высокая однородность клеток в культуральной среде, длительное поддержание их в логарифмической фазе роста. Наиболее простой способ культивирования — накопительная культура, в к-рой клетки постоянно перемешиваются (с помощью магнитной мешалки) в незаменяемой среде. Скорость перемешивания 200—300 об/мин. Для лимфоцитов требуется более высокая скорость — 600 об/мин. Более эффективное перемешивание достигается при циркуляции клеток в трубках. Без смены среды в суспензионных культурах наблюдаются все фазы роста клеточных культур in vitro: lag-фаза, log-фаза, стационарная фаза и фаза логарифмического отмирания.

Добавление свежих порций среды в аппараты суспензионного культивирования в логарифмической фазе дает возможность поддерживать клетки в этой фазе неограниченно долго. На основе этого наблюдения были разработаны проточные суспензионные системы, в которых скорость поступления среды регулируется скоростью размножения клеток. Проточные суспензионные системы могут быть типа хемостатов, в которых подача среды осуществляется по заданной программе с определенным интервалом времени (на основе полученных параметров клеточного размножения). Более совершенна система турбидостатов, в которых подача среды регулируется на основе фотометрических измерений плотности клеточной суспензии. Для бесперебойной работы хемо- и турбидостатов необходимо поддерживать оптимальные условия культивирования: pH среды, концентрацию O2 и CO2, плотность клеток в суспензии, соответствующий состав питательных сред, необходимую температуру.

Суспензионные культуры успешно используют для размножения вирусов гриппа человека и птиц, энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита и т. д. Наиболее широко применяют в суспензионном культивировании среды Хигути, Берча, Нейгла.

Культуры клеток in vivo. Оптимальные условия для жизнедеятельности клеток обеспечиваются организмом. Культивирование клеток и тканей in vivo или пассирование через живой организм осуществляется путем их трансплантации: а) эмбрионам; б) животным с толерантностью к клеткам донора; в) генетически идентичным особям; г) в области, лишенные прямого кровоснабжения (переднюю камеру глаза, мозг, роговицу); д) в диффузионных камерах из миллипоровых фильтров; е) с применением средств, угнетающих иммунную систему реципиента. Удобной моделью культивирования клеток и тканей является хорион-аллантоисная оболочка куриного эмбриона.

Многие экспериментальные опухоли поддерживают путем серийных пассажей на генетически идентичных животных. Гетеротрансплантацию в переднюю камеру глаза применяют для изучения дифференцировки различных нормальных и опухолевых клеток, а также для культивирования органных культур.

Рис. 4. Сканоэлектронограмма клеточной поверхности (указана стрелкой) культивируемой мышиной гепатомы; X 3000.

Культивирование клеток в диффузионных камерах из миллипоровых фильтров (тип АА или НА, с порами, не пропускающими клетки) осуществляется в брюшной полости животных. Клетки в камерах способны не только длительно существовать, но и дифференцироваться. Особенно часто этот метод применяют для ведения органных культур. Перспективны возможности исследования клеток, растущих в диффузионных камерах, методами электронной микроскопии (рис. 4.).

Асцитные опухоли — ряд перевиваемых опухолей животных, которые способны расти в виде свободно взвешенных клеток в экссудате брюшной полости. Некоторые из асцитных опухолей можно культивировать in vitro, что создает уникальную модельную систему для проведения экспериментов, сочетая методы исследования in vivo и in vitro. Наиболее широко в экспериментальной практике используется асцитная форма карциномы Эрлиха; кроме того, получено большое число асцитных форм опухолей у крыс и мышей, которые жизнеспособны в условиях in vitro.

Получение гомо-, гетерокарионов и клеточных гибридов. Методы получения гомо-, гетерокарионов и гибридов соматических клеток in vitro основаны на открытии Барского (G. Barski) с соавт. (1960), обнаружившего, что соматические клетки могут сливаться, образуя жизнеспособные гибриды. Гибридизация соматических клеток проходит несколько этапов. Сначала клетки склеиваются, затем разрушаются клеточные оболочки и образуется цитоплазматический мостик. Полное слияние клеток заканчивается образованием одной общей оболочки. Т. о., получаются двуядерные или многоядерные гомокарионы (если сливаются идентичные клетки) или гетерокарионы (если сливаются клетки разного происхождения). Гомокарионы представляют интерес для изучения поведения многоядерных клеток в культуре. Гетерокарионы нашли применение при решении вопросов регуляции, репрессии и дерепрессии генов. Большое число исследований проведено на гетерокарионах куриных эритроцитов с HeLa-клетками.

Гибриды соматических клеток возникают спонтанно с низкой частотой 10-6 — 10-8. Обработка клеток парагриппозным вирусом Сендай (предварительно инактивированным ультрафиолетовым облучением или бета-пропиолактоном) увеличивает частоту слияния до 10-2—10-3. С использованием вируса Сендай удается получить гибриды соматических клеток, принадлежащих организмам разных видов, классов (млекопитающие X птицы) и даже разных типов (человек X комар). Для образования гибридов успешно используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), который позволил получить слияние клеток от представителей царства растений и животных (растительный протопласт X курица).

Для выделения гибридных клеток после их образования пользуются специальными селективными средами, в которых исходные, родительские, клетки погибают, а выживают только гибриды, отличающиеся от родительских клеток определенным сочетанием маркеров, напр, повышенной резистентностью к действию аналогов оснований ДНК или пониженной потребностью в определенных метаболитах.

Рис. 5. Кариотип крысы (а), мыши (б) и гибридной клетки (в); в гибридной клетке Кариотип содержит хромосомы родительских линий клеток.

Для подтверждения гибридного происхождения выделенных клеток исследуют их Кариотип (рис. 5), определяют присутствие маркерных родительских хромосом, исследуют ферменты и определяют наличие антигенов родительских клеток.

Гибридизация соматических клеток служит основным экспериментальным подходом к картированию генов млекопитающих, в особенности человека. Было обнаружено, что у межвидовых гибридов при культивировании наблюдается предпочтительная утрата хромосом одного из родителей. Так, у гибридов мышь X человек последовательно элиминируют хромосомы человека, что используют для картирования хромосом человека. Развитие методов гибридизации соматических клеток сделало возможным анализ наследования злокачественности на клеточном уровне, изучение механизмов дифференцировки клеток и проблемы регуляции генов.

Кроме описанной гибридизации соматических клеток, разработаны специальные методы получения гибридов для анализа механизмов цитоплазматической наследственности. Получены также гибриды клеток одного типа с отдельными хромосомами из клеток другого типа, с биохим. подтверждением функционирования этих хромосом в гибридной клетке.

Замораживание и хранение клеток при низкой температуре

В конце 19 в. было показано, что бактерии, семена растений и сложные биохим, соединения могут длительно сохраняться при низких температурах. В 50-х гг. 20 в. были сделаны попытки использовать при замораживании клеток вещества, увеличивающие выживаемость,— криопротекторы. Так, Полдж (С. Polge, 1949) обнаружил, что глицерин, добавленный к суспензии клеток, значительно увеличивает их выживаемость. Начиная с 60-х гг. в центре внимания оказался диметилсульфоксид (DMSO). Его широко используют как криопротектор для многих типов клеток. Считают, что главной причиной повреждения клеток при замораживании является повышение концентрации электролитов в клетке или около нее. При температуре ниже 0° в клетках образуются кристаллы льда, которые увеличиваются по мере понижения температуры, соответственно увеличивается в оставшейся среде и концентрация электролитов. Кристаллы льда не образуются при постепенном снижении температуры. Электронно-микроскопические наблюдения свидетельствуют о том, что очень медленное замораживание и быстрое оттаивание вызывают наименьшее повреждение цитоплазматических структур клетки. Для консервирования растущие клетки культуры снимают со стекла трипсином, промывают ростовой средой и помещают в среду замораживания в концентрации клеток 1 млн/мл и более. Среда замораживания — обычная ростовая или поддерживающая среда, содержащая от 2 до 25% сыворотки и криопротекторы: глицерин 5 — 10% или DMSO 5 — 15%. Клетки помещают в специальные стерильные пластиковые или стеклянные ампулы, закрывают или запаивают и начинают охлаждать. До — 20° понижение температуры ведется со скоростью 1° в 1 мин. При замораживании кусочков ткани их измельчают до размера 1 мм3 и проводят аналогичные процедуры. Дальнейшее охлаждение от —20° и до температуры хранения проводят быстро. Хранят замороженные клетки в рефрижераторах с жидким азотом. Предпочтительно хранение в газовой фазе, над жидким азотом, где температура составляет ок. —130°.

Процесс оттаивания должен быть очень быстрым. Ампулы из жидкого азота переносят в водяную баню t° 40°. Как только суспензия полностью оттаивает, ее разводят 1: 10 теплой ростовой средой и рассеивают. Можно предварительно отцентрифугировать клетки и залить свежей ростовой средой. Кусочки промывают и как можно быстрее инокулируют. После 6 мес. хранения культур, замороженных и оттаянных описанным способом, наблюдается 100% выживаемость клеток.

Транспортировка клеток на большие расстояния возможна либо в виде суспензии, либо в виде монослоя в культуральном флаконе, полностью заполненном средой. Возможна транспортировка клеток в замороженном состоянии при температуре кипения жидкого азота в специальных контейнерах и на сухом льду.

Культуры клеток и тканей в радиобиологии

Культуры клеток и тканей широко применяются в радиобиологии. Интерес к ним обусловлен возможностью изучать радиационную патологию клетки, изолированную от влияния других клеточных систем или нейрогуморальных факторов, которые имеют место в организме.

Культуры клеток используют при разработке вопросов механизма действия ионизирующего излучения на клетку (см. «Мишени» теория), проблемы клеточной радиочувствительности, вопросов поражения и восстановления клеток при действии ионизирующих излучений и др. Установлены, напр., закономерности изменения частоты хромосомных аберраций в зависимости от мощности дозы излучения. При относительно больших мощностях дозы излучения (более 0,5—1 р/мин) частота хромосомных аберраций растет с увеличением дозы ионизирующего излучения и составляет примерно 0,15% на каждый рад дозы. В условиях применения малых мощностей доз излучения (0,2—0,0002 р/мин) данная зависимость (доза — эффект) существенно изменяется; рост эффекта (напр., частоты хромосомных аберраций) от дозы ионизирующего излучения выражен тем слабее, чем меньше мощность дозы излучения, что свидетельствует о снижении биол, эффективности ионизирующего излучения. При продолжительном действии малых мощностей доз ионизирующего излучения возникает стабилизация эффекта, при к-рой, несмотря на продолжающееся облучение культур, уже не происходит дальнейшего повышения частоты хромосомных повреждений, хотя суммарные дозы, полученные клеточной популяцией, могут составлять 5000—10 000 р. Уровень стабилизации эффекта в этих условиях различен и пропорционален величине мощности дозы излучения. Наблюдаемые изменения связывают с тем, что в условиях продолжительного действия ионизирующего излучения облучение захватывает ряд поколений клеток. В облучаемой популяции устанавливается равновесие между интенсивностью возникновения лучевых повреждений в клетках и скоростью их репарации.

Использование синхронных культур позволило получить новые данные о действии радиации на жизненный цикл клетки: выявлены значительные колебания радиочувствительности, детально прослежен характер возникновения хромосомных и хроматидных аберраций, обнаружены участки клеточного цикла, ответственные за задержку синтеза ДНК и митоза и т. п.

Например, наибольшая радиочувствительность, как правило, характерна для клеток, находящихся в момент облучения в период митоза (М), тогда как в пресинтетический (G1) или премитотический (G2) периоды они в 2—5 раз более радиорезистентны. В период синтеза ДНК(S) радиочувствительность чаще имеет промежуточное значение, но отмечаются признаки повышенной репаративной способности клеток.

В радиационной генетике приемы культивирования обеспечивают не только возможность приготовления высококачественных препаратов для тонкого хромосомного анализа (метафазные пластинки) различных видов клеток, в т. ч. и редко делящихся (культивирование с фитогемагглютинином), кроме того, культуры различных клеток являются объектом для разносторонних исследований действия радиации на генетические структуры клеток. Они имеют первостепенное значение в исследовании генных трансмутаций и мутаций. С их помощью выявлены биохим, мутанты, устойчивые к лекарственным препаратам, с измененной радиочувствительностью и т. п.

рис. 6. Зависимость частоты повреждений хромосом (появление дицентриков) от дозы облучения в культуре лейкоцитов периферической крови в расчете на одну клетку: эффект возрастает при увеличении дозы облучения (кривые построены по данным различных авторов).

Для диагностики радиационных поражений наибольшее значение пока имеет определение частоты и типа хромосомных аберраций, возникающих в клетках костного мозга и периферической крови (рис. 6).

Рис. 7. Кривые, характеризующие выживаемость клеток китайского хомячка, облученных в пресинтетической стадии (2), в сочетании с введением препарата БУдр (1) и цистеамина (3): отмечается защитный эффект цистеамина и радиосенсибилизирующее действие препарата БУдР.

Культуры клеток находят применение при изучении действия хим. радиопротекторов и радиосенсибилизаторов. Введение различных хим. веществ в питательную среду облученных культур с последующим анализом выживаемости, частоты хромосомных аберраций или иных объективных показателей лучевого поражения клеток позволяет быстро и с достаточной точностью судить о характере и эффективности их действия на клетки (рис. 7).

Имеются, однако, и определенные ограничения использования культур в радиобиол. и иных исследованиях. Они связаны в первую очередь с тем,, что в однослойных культурах удается обеспечивать только размножение клеток, тогда как второй чрезвычайно важный процесс жизнедеятельности клетки — процесс дифференцировки — быстро затухает. Поэтому в радиобиологических исследованиях чаще используют перевиваемые клеточные линии, а не первичные культуры.

Культуры клеток и тканей в онкологии

Культуры клеток и тканей как метод научного исследования широко применяется в современной онкологии. Метод позволяет на клеточном уровне изучать этиол, факторы и патогенетические механизмы процесса малигнизации, биол, особенности и закономерности поведения и взаимодействия нормальных и опухолевых клеток, механизмы действия канцерогенных и противоопухолевых веществ, а также иных хим., физ. и биол, агентов. В системе К. к. и т. возможно культивирование онкогенных вирусов (см.).

В условиях К. к. и т. закономерно воспроизводится феномен канцерогенеза или малигнизации нормальных клеток. Малигнизация клеток в К. к. и т. может происходить под воздействием онкогенных вирусов, хим. канцерогенных веществ, а также без специальных воздействий (спонтанно).

О первых попытках вызвать малигнизацию клеток вне организма сообщил А. Каррель в 1924 г. С этой целью автор использовал вирус саркомы Рауса. Возникновение опухолей на месте прививки обработанных вирусом куриных моноцитов оставило открытым вопрос, является ли развитие опухолей результатом малигнизации клеток in vitro или следствием действия вируса, размножившегося в культуре клеток. В дальнейшем, по мере выделения и изучения иных онкогенных вирусов, было показано их прямое действие на клетки в К. к. и т. Онкогенные вирусы (ДНК- и РНК-содержащие) вызывают в К. к. и т. развитие процесса трансформации, в ходе к-рого клетки претерпевают наследуемые морфол., кариологические, физиол., антигенные и другие изменения. В случаях злокачественной трансформации клетки приобретают способность образовывать при прививке животным опухоли. Наиболее изучено в К. к. и т. действие таких онкогенных вирусов, как вирус полиомы, SV40, аденовирус, вирус саркомы Рауса и др. Некоторые Онкогенные вирусы способны вызывать злокачественную трансформацию культур клеток человека.

Начиная с опытов Фишера (A. Fischer, 1926) проводятся исследования с целью вызывать малигнизацию клеток хим. канцерогенными веществами. М. А. Магат, А. Д. Тимофеевский, Л. Ф. Ларионов и др. после воздействия многоядерными ароматическими углеводородами (1, 2, 5, 6-дибензантрацен, 3,4-бензпирен) наблюдали в культурах появление морфол, изменений, похожих на трансформацию вирусного происхождения. В последующих опытах с канцерогенными веществами, гл. обр. в условиях монослойных культур, разным авторам удалось вызвать наступление злокачественной трансформации. Тем не менее возможность присутствия в клетках латентных, в т. ч. онкогенных, вирусов оставляет открытым вопрос о самостоятельном малигнизирующем действии на клетки хим. канцерогенных веществ.

В 1941 —1943 гг. в лабораториях Гая (G. О. Gey) и Эрла (W. Earle) было установлено, что малигнизация клеток может происходить без специальных воздействий в результате длительного культивирования. Так наз. спонтанная малигнизация наступает в монослойных культурах спустя несколько месяцев после начала культивирования. В культурах наблюдаются признаки трансформации: изменяется морфология, в клетках возрастает число хромосом (гетероплоидия), скорость роста увеличивается. Прививка таких культур животным часто вызывает развитие опухолей. Причины спонтанной малигнизации в К. к. и т. окончательно не изучены. Придается значение факторам питательной среды, отсутствию гомеостатических влияний организма, переносу клеток в специфические условия К. к. и т. и т. д. Имеются сведения об участии в спонтанной малигнизации онкогенных вирусов, микоплазм.

Культуры клеток и тканей являются удобной экспериментальной системой для выращивания и изучения опухолей вне организма.

Первые попытки культивировать (эксплантировать) опухоли человека были предприняты в 1910 г. А. Каррелем и Берроузом (М. Т. Burrows). В 1913 г. П. П. Авророву и А. Д. Тимофеевскому впервые удалось выращивать клетки крови и костного мозга больных лейкозами, а в 1914 г. они эксплантировали несколько сарком человека. Последующие многочисленные исследования эксплантатов опухолей показали, что опухолевые клетки в К. к. и т. могли проявлять признаки тканевой принадлежности, что позволило исследовать гистогенез ряда опухолей человека. Была показана миогенная природа некоторых сарком, уточнен генез новообразований яичников, матки, смешанной опухоли околоушной слюнной железы, малодифференцированных опухолей легкого, новообразований ц. н. с., доказана нейрогенная природа меланом и т. д. Отмеченная способность анаплазированных опухолевых клеток к дифференцировке (созреванию) соответственно их генезу, по мнению А. Д. Тимофеевского, позволяет ставить вопрос о возможности направленного изменения их биол, свойств.

Рис. 8. Нативные микропрепараты культур клеток опухолей человека (стрелками указаны эпителиальные клетки опухоли): а — солидный рак молочной железы, х 56; б — цистаденокарцинома яичника, х 56; в— бронхогенный рак легкого, х 80; г— аденокарцинома желудка, х 80

Общий вид некоторых культур клеток опухолей человека представлен на рисунке 8.

Рис. 9. Развитие эпителиоподобных гетероплоидных клеток клеточной линии CaVe из карциномы желудка человека: а — гистологический срез исходной солидной карциномы желудка; окраска гематоксилин-эозином, х 80; б— трансформация культуры через 1,5 —2 месяца после посева исходной опухоли (стрелками указано появление островков в эпителиоподобных клетках); окраска гематоксилином, X 80; в— монослой однородных эпителиоподобных клеток (нативный препарат, х 80)

Эксплантация опухолей человека преследовала цель получить длительные культуры опухолевых клеток. Однако при выращивании на слое плазмы энергия роста культур ослабевала и клетки гибли. Лишь разработка методики однослойных культур с применением синтетических питательных сред позволила длительно поддерживать рост и размножение опухолевых клеток человека и животных. В условиях монослоя, как и на слое плазмы, продолжительность жизни опухолевых клеток ограничена, если в культуре не наступят изменения, выражающиеся в появлении эпителиоподобных гетероплоидных клеток, которые вытесняют иные клеточные формы (рис. 9). Клетки таких трансформированных культур опухолей способны к неограниченному росту вне организма. В трансформации не исключается роль вирусов, мутагенных веществ, радиации и т. д.

Культуры трансформированных опухолевых и нормальных клеток (клеточные линии) обнаруживают сходство характеристик. Наряду со сходной эпителиоподобной морфологией и субмикроскопическим строением в культурах преобладают клетки с гетероплоидными, чаще околотриплоидными кариотипами. Пролиферативный пул таких популяций высок, а продолжительность клеточного цикла невелика. Трансформированные культуры, утрачивая большинство антигенов, сохраняют видовую специфичность и приобретают культуральный антиген. Опухолевые клетки сохраняют опухолевый антиген, а нормальные при малигнизации — приобретают его. В культурах на фоне пониженного дыхания усиливается гликолиз, увеличивается сродство к глюкозе, изменяется изоэнзимный спектр некоторых ферментов и т. д. Унификация характеристик культур в ряде случаев ставит вопрос о загрязнении (контаминации) одних клеточных культур другими, в т. ч. клетками HeLa, что в каждом случае должно решаться индивидуально.

Рис. 10. Микропрепараты клеточных линий из опухолей человека (монослойные культуры): а— линия HeLa из карциномы шейки матки; б— линия КВ из карциномы полости рта; в— линия CaPa из карциномы поджелудочной железы; г— линия AS из ангиосаркомы. Окраска гематоксилином, х 200.

Первая линия HeLa опухолевых клеток человека была получена в 1951 г. из плоскоклеточного рака шейки матки (Гай с соавт., 1952). Известны и используются в различных исследованиях линии КВ из карциномы полости рта [Игл (Н. Eagle), 1955], H Ер-2 карциномы гортани [Мур (А. Moore) с соавт., 1955], серия клеточных линий «Detroit» [Берман и Сталберг (L. Berman, С. Stulberg), 1957] и др. В нашей стране получены и поддерживаются линия AS из ангиосаркомы (А. М. Ерошкина, 1956), линия ДАПТ из дифференцированной астроцитомы (М. С. Бенюмович с сотр., 1962), линии CaPa, CaVe, CaOv, TuWi из карцином поджелудочной железы, желудка, яичника и опухоли Вильмса (Я. В. Добрынин с сотр.). Описаны десятки линий опухолевых клеток человека и животных, выращиваемые в однослойной культуре (рис. 10), а также линии клеток крови и костного мозга больных лейкозами, поддерживаемые в виде суспензионных культур. Многие поддерживаемые в однослойной культуре линии опухолевых клеток человека являются вариантами линии HeLa.

Рис. 11. Сканоэлектронограмма клеток в монослойной культуре (указаны стрелками): а — нормальные фибробласты, распластанные и хорошо прикрепленные к подложке; б— малигнизированные фибробласты линии L (округлившиеся и слабо прикрепленные к подложке клетки); X 2000.

В К. к. и т. изучены особенности поведения и взаимодействия опухолевых клеток. По данным Аберкромби и Амброуза (М. Abercrombie, E. Ambrose, 1958), поведение опухолевых клеток определяется утратой способности тормозить движение при контакте с другими клетками (см. Контактное ингибирование роста), задерживать вступление в митоз при контакте, а также ориентироваться на поверхности. По Ю. М. Васильеву (1968), в основе патол, поведения лежит не столько неспособность опухолевых клеток к контактному ингибированию движения, сколько нарушенная реакция прикрепления за счет дефекта в организации ламеллярной цитоплазмы — структуры, формирующейся при контакте клеточной поверхности с субстратом (рис. 11).

В К. к. и т. впервые было отмечено снижение и утрата опухолеобразующих свойств длительно культивируемыми опухолевыми клетками. Эти наблюдения касались как клеток, малигнизировавшихся в культуре [Эрл и Сенфорд (К. К. Sanford), 1958], так и полученных непосредственно из опухолей [Фолей (G. Foley), 1965]. Феномен утраты злокачественности в К. к. и т. мало изучен. Предполагается, что снижение и утрата опухолеобразующей способности могут быть обусловлены селекцией более зрелых и менее злокачественных клеток под влиянием факторов среды.

Допускается, что извращение антигенного комплекса вследствие длительного культивирования опухолевых клеток может приводить при трансплантации к развитию тканевой несовместимости.

Культуры клеток и тканей используются для изучения эффектов и механизмов действия различных биол., физ. и хим. агентов. Важно использование К. к. и т. для изучения химиотерапевтических препаратов, применяемых в онкол. клинике, и отбора новых противоопухолевых веществ. Критериями биологического (цитотоксического) действия таких веществ могут быть общее количество и число погибших и жизнеспособных клеток, содержание в культурах белка и нуклеиновых к-т, степень угнетения ферментов, уровень включения клетками радиоактивных предшественников синтеза нуклеиновых к-т, белка и т. д. Культуры клеток и тканей позволяют отбирать потенциально противоопухолевые цитотоксические вещества, в то время как исследование их специфической противоопухолевой активности возможно лишь в опытах на животных.

В К. к. и т. определяют индивидуальную чувствительность опухолей человека к противоопухолевым препаратам с целью последующего лекарственного лечения. Для этого преимущественно используют кратковременные культуры опухолей. Критерии оценки действия препаратов те же, что при отборе цитостатиков. Определение спектра чувствительности опухолей к набору противоопухолевых препаратов (онко-биограмма) позволяет подобрать более эффективный для данного больного противоопухолевый препарат По вопросу о корреляции данных онкобиограммы и результатов последующего лечения нет единого мнения.

Развитие и усовершенствование метода К. к. и т. способствовали его широкому и успешному использованию в различных онкол, исследованиях. Изучены многие биол, свойства и особенности опухолевых клеток, некоторые причины и механизмы канцерогенеза и т. д. Однако ряд ключевых проблем онкологии, таких как спонтанная малигнизация, дифференцировка опухолевых клеток, утрата ими опухолеобразующих и других свойств, еще ожидает своего решения.

Культивирование костного мозга

Костный мозг является незаменимым объектом для изучения процессов пролиферации и дифференцировки клеток вообще и кроветворных клеток в особенности. Он представляет собой гетерогенную клеточную популяцию, состоящую из пролиферирующих и дифференцирующихся клеток. Дифференцировка протекает в виде ряда последовательных стадий, легко различимых функционально или морфологически. В отличие от большинства других тканей, костный мозг может быть легко получен от живого человека.

История изучения костного мозга в культуре начинается с работы А. Карреля и Берроуза (М. Т. Burrows), культивировавших костный мозг и селезенку в плазменного сгустке еще в 1910 г.

В последующие годы методы культивирования кроветворных тканей развивались и использовались А. А. Кронтовским, А. А. Максимовым, Фишером (A. Fischer), Эфрусси (В. Ephrussi) и др. Несмотря на то, что в этих работах были установлены основные особенности поведения кроветворных клеток в культурах, разработаны методические подходы культивирования костного мозга, уточнены схемы кроветворения (прежде всего А. А. Максимовым), исследователям не удалось получить истинных культур костного мозга, т. е. культур, в которых происходит нарастание массы эксплантированных клеток. Задача эта не решена и к концу 70-х гг. 20 в. При всех используемых методах культивирования кроветворные клетки длительно переживают и самоподдерживаются без существенного увеличения их числа.

Методы культивирования костного мозга можно разделить на две группы — клональные и неклональные.

Клональные методы

Основное назначение таких культур заключается в выявлении различных категорий клеток-предшественников, т. е. клеток, способных проделать достаточное число делений для образования клона из нескольких десятков — тысяч клеток (см. Кроветворение). Необходимые условия для получения клонального роста — среда, обеспечивающая относительную иммобилизацию клеток (чтобы клетки-потомки не мигрировали далеко из зоны пролиферации), низкая плотность посева (чтобы клоны не перекрывали друг друга) и присутствие в среде факторов, способствующих пролиферации и дифференцировке клонообразуюших клеток. Эти условия удалось выполнить для клеток-предшественников всех трех ростков кроветворения.

Культивирование клеток — предшественников гранулоцитов и макрофагов. В качестве иммобилизирующей среды используют агар (конечная концентрация 0,3%) или метилцеллюлозу (конечная концентрация 0,8%). Для роста используют хим. среды, отличающиеся для разных видов животных. Наиболее часто используют среду Мак-Коя 5А, среду 199, РПМИ 1640, среду Игла и др. В бессывороточных средах клоны не образуются, поэтому обязательно добавление 10—30% сыворотки (чаще всего эмбриональной телячьей, плацентарной человеческой и др.). Без добавления экзогенного фактора — колониестимулирующей активности (КСА) колонии не образуются при обычных плотностях посева (1—3 X 105 клеток на 1 мл среды); незначительное число колоний развивается при высокой плотности клеток, порядка 10^6 клеток на 1 мл среды и выше. Как правило, культуры ведут в присутствии экзогенного фактора — колониестимулирующей активности. В качестве последнего используют кондиционированные среды от культур различных клеток и тканей (фибробластов, моноцитов, злокачественных клеток, почек новорожденных животных, легких, плаценты и др.), сыворотки от нормальных животных или животных с лейкозом либо получавших эндотоксин и т. д. Применяют также и фидер (клеточный подслой, кондиционирующий среду). В этом случае фидер обычно культивируют в нижнем слое более плотного агара (0,5%), на который наслаивают клетки костного мозга в мягком агаре (0,3%). Такой вариант метода наиболее часто используют при культивировании костного мозга человека. В этом случае в качестве фидера используют лейкоциты периферической крови в концентрации 106 клеток на 1 мл среды.

Рис. 12. Типы колоний клеток костного мозга в агаровой культуре: а— компактная (гранулоцитарная); б— диффузная (Макрофагальная); в— смешанная; х 36.

Плотность клеток костного мозга при посеве обычно 1—3 X 105 клеток на 1 мл среды. Регистрацию колоний ведут под инвертированным микроскопом после инкубации в течение 7 —14 дней при t° 37° в атмосфере, представляющей смесь 5 — 10% CO2 с воздухом (газовая фаза). За колонию принимают клеточное скопление, состоящее обычно из более чем 50 клеток; все клеточные скопления меньшей величины называются кластерами. Предполагается, что кластеры образуются более зрелыми клетками, способными проделать в культуре меньшее число митозов. Наблюдаются три типа колоний — компактные (гранулоцитарные), диффузные (макрофагальные) и смешанные (рис. 12).

Культивирование клеток — предшественников эритроцитов. Принципы такого рода культур те же, что и для предшественников гранулоцитов. В качестве поддерживающего субстрата используют плазменный сгусток (10% цитратная плазма крупного рогатого скота) или метилцеллюлозу (агар для этих культур не пригоден). Для возникновения клонов необходимо присутствие в среде эритропоэтина (ок. 0,25 ед/мл). Различают два типа колоний. Один из них — мелкая колония, состоящая из 8—32 клеток. Счет таких колоний осуществляют через 2 — 3 дня после эксплантации. В более поздние сроки клетки в колониях созревают до эритроцитов и лизируются. Через 5 —10 дней культивирования в присутствии более высоких концентраций эритропоэтина (до 10 ед/мл) возникают большие колонии (свыше 32 клеток, обычно — несколько сотен клеток) или очаги из нескольких мелких колоний. Такой очаг получил название бурста (англ. burst-взрыв). Предполагают, что эти типы колоний образуются разными предшественниками. Менее зрелые предшественники продуцируют бурсты, более зрелые — мелкие колонии.

Культивирование клеток — предшественников мегакариоцитов. Эти предшественники образуют колонии магакариоцитов в агаровых культурах в присутствии меркаптоэтанола (конечная концентрация 5 X 10-5 М). В качестве источника колониестимулирующей активности используют кондиционированную среду культур лимфоцитов селезенки. Длительность культивирования 7 — 10 дней.

Рис. 13. Колонии фибробластов в монослойных культурах костного мозга морской свинки (указаны стрелками): а— общий вид колоний (уменьшено в 2 раза); б— фрагмент колонии; х 400.

Культивирование клеток — предшественников стромальных механоцитов. При культивировании костного мозга в культуре пролиферируют не только кроветворные, но и стромальные клетки. Последние прочно прикрепляются к стеклу и относительно малоподвижны, в связи с чем образование клонов можно наблюдать не только в полужидких, но и в жидких культурах, где клоны образуются в виде прикрепленных ко дну сосуда клеточных скоплений (рис. 13). Такие культуры ведутся в полных средах (химически определенная среда с добавкой 10—30% сыворотки, чаще всего эмбриональной телячьей). Клеточная концентрация при эксплантации 1—3 X 105 клеток на 1 мл среды. Количество среды определяется площадью дна сосуда для культивирования (примерно 1 мл среды с клетками на 4 см2). Колонии считают через 10—14 дней культивирования невооруженным глазом после окраски (напр., гематоксилином) .

Клональные методы культивирования костного мозга используют очень широко; они стали уже обычными методами исследования больных во многих гематол, клиниках мира. С их помощью были получены исключительно важные данные о кроветворной системе. В частности, удалось показать, что в костном мозге и других кроветворных органах содержатся клетки-предшественники, промежуточные между стволовой кроветворной клеткой и морфол, распознаваемыми клетками соответствующих рядов кроветворения. В связи с этим все категории кроветворных предшественников объединяют в отдел коммитированных предшественников, получивший название буферного отдела. Выявлены следующие категории предшественников: клетка — предшественник гранулоцитов и макрофагов, колониеобразующая единица в культуре (КОЕк); ранний эритроидный предшественник, бурстообразующая единица (БОЕэ); поздний эритроидный предшественник, колониеобразующая единица эритроидная (КОЕэ); предшественник мегакариоцитов, колониеобразующая единица мегакариоцитарная (КОЕм); стромальный предшественник, колониеобразующая единица фибробластная (КОЕф). Все категории кроветворных предшественников представляют собой морфологически клетку, промежуточную между лимфоцитом и бластом. При нормальном кроветворении эти клетки пролиферируют и темп их пролиферации регулируется гормонами. Детально охарактеризован только один из таких гормонов — эритропоэтин; являются ли лейкопоэтины и тромбопоэтины регуляторами, экспериментально не доказано. Установлены клеточные циклы предшественников и их потомков в культуре. Обнаружены факторы, стимулирующие пролиферацию колониеобразующих единиц в культуре, и выявлены некоторые костномозговые популяции, способные к продукции этих факторов. Доказано, что при лейкозах могут страдать как клетки-предшественники, так и продуцирующие колониестимулирующую активность клетки. Обнаружены корреляции между течением лейкоза и характеристикой колониеобразующих единиц в культуре и т. д.

Оказалось, что клетки стромальных предшественников при стабильном кроветворении в организме не пролиферируют. Они способны при трансплантации построить строму костного мозга, на к-рую происходит репопуляция кроветворных клеток, и возникает очаг эктопического кроветворения.

В целом использование клональных методов культивирования костного мозга способствовало выявлению новых данных о строении кроветворной системы, о наличии и свойствах ряда категорий клеток-предшественников, о регуляции пролиферации и дифференцировки этих клеток и т. д. Использование этих методов продолжает интенсивно расти.

Неклональные методы культивирования костного мозга

Основная задача этих методов культивирования — получение стабильных длительных культур кроветворной ткани, с постоянной продукцией кроветворных клеток, в т. ч. и стволовых кроветворных клеток,— все еще не решена. При всех существующих методах культуры более или менее быстро истощаются либо в них продолжается рост, но не кроветворных, а стромальных клеток. Однако и в таком виде неклональные культуры широко используют для изучения ряда принципиальных вопросов функционирования костного мозга.

Органные культуры костного мозга. В органных культурах поддерживается органотипический рост ткани, без увеличения клеточной массы эксплантата. В таких культурах костный мозг фрагментом или густой взвесью эксплантируют на подложку (миллипоровые фильтры, различные мембраны и др.), находящуюся на поверхности среды. Питательные вещества диффундируют из среды в эксплантат, а продукты жизнедеятельности последнего диффундируют в среду. Рост на границе жидкой и газовой фаз способствует сохранению органных структур, что удлиняет функционирование культуры. Такая кроветворная ткань, как эмбриональная печень, может поддерживаться в культуре в течение нескольких недель. Состав питательной среды и газовой фазы такой же, как и при клональных методах культивирования.

Культивирование костного мозга в жидких средах. В отличие от органных культур, при культивировании костного мозга в жидких средах используют клеточные взвеси, а не фрагменты кроветворных тканей. Плотность эксплантации — обычно от 0,5 до 2 млн. клеток в 1 мл. Питательную среду меняют по мере закисления, в зависимости от интенсивности роста клеток. Вариантом культур этого рода является система Марбрука, при к-рой костномозговые клетки с небольшим количеством среды (1 мл) помещают в сосуд с дном из целлофановой мембраны. Этот сосуд помещают в колбу с 50 мл питательной среды. Такая система не требует частой смены среды и в то же время обеспечивает достаточную клеточную плотность.

Неклональные методы культивирования кроветворных клеток широко используют для изучения кинетики различных клеточных популяций, для изучения различных биохим. процессов в клетках и механизмов их индукции (напр., синтез гемоглобина в эритроидных клетках), для исследования клеточных дифференцировок и морфофункциональных характеристик различных популяций кроветворных клеток. Важное место занимает изучение кооперативных взаимодействий клеток в культуре, гуморальных факторов регуляции кроветворения и т. д. Продолжаются попытки получения истинной культуры костного мозга с увеличением массы кроветворных клеток.

С помощью неклональных культур изучены клеточные циклы многих категорий кроветворных клеток, исследованы факторы, индуцирующие дифференцировку в нормальных и некоторых лейкозных клетках, создана наиболее чувствительная система определения эритропоэтина, охарактеризованы многие факторы, стимулирующие кроветворение, и др. Получены первые данные о возможности длительного поддержания кроветворения в культуре.

Культивирование костного мозга в диффузионных камерах. При таком методе культивирования костный мозг в виде клеточной взвеси в полной питательной среде помещают в камеру (объем 0,1—0,2 мл) со стенками из миллипорных или, лучше, нуклеопорных фильтров, величина пор которых (0,22 мкм) не препятствует проникновению в камеру питательных веществ и удалению продуктов обмена. В то же время камеры непроницаемы для клеток. Диффузионные камеры помещают внутрибрюшинно животным, обычно мышам. Т. к. камеры непроницаемы для клеток, в т. ч. и для лимфоцитов, выраженной иммунол, реакции против клеток в камере не происходит, и в брюшной полости мышеи можно культивировать клетки любых видов животных и человека. Рост клеток лучше, если камеру помещают в организм облученного реципиента. Обычно культуры исследуют в течение первых 7—9 дней. Если требуется более длительное культивирование, камеры 1 раз в неделю очищают от наросшей снаружи соединительной ткани и переносят к следующему реципиенту. При съеме культур камеру обрабатывают ферментом проназой, к-рая освобождает кроветворные клетки и позволяет перевести их во взвесь для изучения числа, морфол, и функц, особенностей и т. д.

Такой вариант культур наряду с очевидными недостатками (невозможность изучения гуморальных факторов, особенностей питания, природы регуляторов и т. д.) имеет ряд преимуществ — простота, хорошая воспроизводимость, несложность сред, лучшие условия для клеток, что делает метод все более популярным. С его помощью изучены кинетика превращения исходных культур в камерах, направление дифференцировки кроветворных клеток, межклеточные взаимодействия (в двойных камерах, разделенных фильтром) и др.

Проблема культивирования костного мозга находится в стадии активного развития. В перспективе этих исследований — создание метода определения стволовых кроветворных клеток в культуре, создание стабильных культур кроветворных клеток, получение прироста клеточной массы в культурах костного мозга. Решение этих проблем явится одним из важнейших шагов в прогрессе знаний в области нормального кроветворения и механизмов его малигнизации.


Таблица. Краткая характеристика основных культур клеток (по данным отечественной и зарубежной литературы)

Условные обозначения культур клеток

Полное наименование культуры клеток

Среда культивирования

Особенности кариологии

Биохимические и другие маркеры

Туморогенность

Чувствительность к вирусам

Культуры клеток человека

AV3

Культура амниотических клеток человека

Среда 199 + 20% сыворотки крупного рогатого скота

Гипердиплоидный Кариотип, 2n = (58 — 95) хромосом, модальный класс — 74 — 75 хромосом

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г-6-ФД), тип А

Вирусы полиомиелита

CCRF-

СЕМ

Культура лимфобластоидных клеток больного острой лимфобластной лейкемией

Среда Игла (МЭМ) + 10% эмбриональной сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип, 2n = (41—95) хромосом, модальный класс — 47 хромосом

Пригодна для суспензионного культивирования Г-6-ФД, тип А

1 X 10^8 клеток, инъецированных внутрибрюшинно новорожденным сирийским хомячкам, вызывают лейкемию

Chang

liver

Культура клеток нормальной печени человека

Среда Игла -f 10% сыворотки крупного рогатого скота

Гипердиплоидный Кариотип 2n = (62— 82) хромосом, модальный класс — 70 — 71 хромосомы

Г-6-ФД, тип

А

Индуцирует опухоли в защечных мешках сирийского хомячка при инокуляции 1 х 10« клеток

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита, аденовирус человека, тип 3

СНР-3

Культура клеток кожи больного галактоземией

Среда Игла (МЭМ) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Околодиплоидный Кариотип 2n=(44—47) хромосом, модальный класс — 46 хромосом

Г-6-ФД, тип А, дефицитны по галактозо-1-фосфатуридилтрансферазе

Вирусы полиомиелита, тип 1, везикулярного стоматита, герпеса человека

Citrullinemia

Диплоидная культура клеток с кожи больного цитруллинемией

Среда Игла с двойным набором аминокислот и витаминов + 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Диплоидный Кариотип 2n = 46 хромосом

Г-6-ФД, тип В, проходит 34 пассажа

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита, герпеса человека

Cri-duchat

Диплоидная культура клеток кожи больного с синдромом кошачьего крика

Среда Мак-Коя + + 20% эмбриональной телячьей сыворотки

Диплоидный Кариотип 2n=46 хромосом, делеция в 5-й хромосоме

Г-6-ФД, тип

В, проходит 35 пассажей

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита, герпеса человека, оспы

Dempsey

Культура клеток кожи больного с синдромом Клайнфелтера

Среда Мак-Коя + + 20% эмбриональной телячьей сыворотки

Кариотип 2n=49 хромосом, набор половых хромосом XXXXV

Г-6-ФД, тип В

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита

Detroit-6

Культура клеток костного мозга больного раком легкого

Среда Игла (МЭМ) + 10% человеческой сыворотки

Гипердиплоидный набор 2n = (51 — 75) хромосом, модальный класс —65 — 66 хромосом

Г-6-ФД, тип А

Вирусы полиомиелита, Коксаки В, тип 1, 3 — 5, аденовирусы человека, тип 1 —11, осповакцины, герпеса человека, японского и западнонильского энцефалита, шотландского энцефалита овец

D38S

Культура клеток нормального костного мозга (клон Detroit-98)

Среда Игла (МЭМ) + 10% человеческой сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип 2n = (54— 118) хромосом, модальный класс — 61 — 62 хромосомы

Г-6-ФД, тип А, продуцирует мутации устойчивости к 8-азагуанину

Вирусы полиомиелита, аденовирус человека, тип 3

Detroit-525

Культура клеток кожи больной синдромом Шерешевского — Тернера

Среда Игла (МЭМ) +0,1 % гидролизата лактальбумина + 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Кариотип 2n=45 хромосом, набор половых хромосом XO + центрический фрагмент в 95% клеток

Г-6-ФД, тип В, проходит 30 пассажей

Вирусы полиомиелита

Detro

it-532

Культура клеток кожи больного с синдромом Дауна

Среда Игла (МЭМ) + 0,1% гидролкзата лактальбумина +

+ 10% эмбриональной сыворотки

Кариотип 2n=47 хромосом, трисомия по 21-й хромосоме

Г-6-ФД, тип В, проходит 30 пассажей

Вирусы полиомиелита, Коксаки А, тип 9, парагриппа, тип 3, герпеса человека, аденовируса человека, тип 3, 7

Detro

it-548

Культура клеток кожи больного с частичной трисомией по хромосоме D

Среда Игла (МЭМ) +0,1% гидролизата лактальбумина + +10% эмбриональной телячьей сыворотки

Кариотип 2n=46 хромосом, транслокация D хромосомы на хромосоме группы С (С+, D-)

Г-6-ФД, тип В

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита

Detro

it-550

Диплоидная культура клеток кожи нормального мужчины

Среда Игла (МЭМ) +0,1% гидролизата лактальбумина +

+ 10 % эмбриональной телячьей сыворотки

Диплоидный нормальный Кариотип 2n=46 хромосом

Г-6-ФД, тип В, проходит 25 пассажей

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита. Можно трансформировать вирусом SV40

EB-3

Культура клеток больного лимфомой Беркитта

Среда PPMI + 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Диплоидный Кариотип 2n=46 хромосом, 4 % полиплоидных клеток

Г-6-ФД, тип А, растет в суспензии

Содержат вирус Эпстайна—Барра

Elain-IV

Культура клеток крови больного инфекционным мононуклеозом

Среда RPMI +

+ 20% эмбриональной телячьей сыворотки

Стволовая линия с диплоидным кариотипом 2n=46 хромосом

Г-6-ФД,

тип В

Содержат вирус Эпстайна—Барра

FL

Культура клеток нормального амниона человека

Среда Игла + 1 5% человеческой сыворотки + 5% глицерола

Гипердиплоидный Кариотип 2n=(68—80) хромосом, модальный класс — 71 — 72 хромосомы. Все клетки содержат субметацентрическую маркерную хромосому

Г-6-ФД,

тип А

Вирусы полиомиелита, Коксаки А, тип 11, 13, 15, 18, Коксаки В, тип 1—6, осповакцины, кори, аденовирусы человека, тип 1, 2, 3, 5, 7

Girardi

heart

Культура клеток сердца человека

Среда Игла (МЭМ) +10% телячьей сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип 2n=(55—86) хромосом, модальный класс не выражен. Две маркерные хромосомы

Г-6-ФД, тип А

Индуцируют опухоли в защечных мешках сирийского хомячка при инъекции 1 х 106клеток

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита, аденовирус человека, тип 3

HeLa

Культура клеток карциномы шейки матки человека

Среда Игла (МЭМ) +10% человеческой сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип 2n=(70—86) хромосом, модальный класс — 81—83 хромосомы, маркерный телоцентрик

Г-6-ФД, тип А

Вирусы полиомиелита, вирусы Коксаки А, тип 7, 9, 11, 13, 15, 18, 20, 21, 23, Коксаки В, тип 1—6, ECHO, тип 1 — 3, 5—15, 17—21, 24—26, 28—30, 32, реовирусы гриппа человека А и В, аденовирусы человека, тип 1 — 31, герпеса человека, обезьян и свиней, ветряной оспы, паротита, кори, оспы человека, SV40, многие аденовирусы и др.

HEp-2

Культура клеток карциномы гортани человека

Среда Игла +15 % телячьей сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип, модальный класс — 75—78 хромосом

Г-6-ФД, тип А

Вирусы полиомиелита, Коксаки А, тип И, 13, 15, 18, Коксаки В, тип 1—6, осповакцины, кори, гриппа В, парагриппа, тип 1 — 3, паротита, кори, герпеса человека и свиней, респираторно- синцитиальный, ящура, энцефаломиокардита, аденовирусы человека, тип 3, 4, 6—8, везикулярного стоматита и ряда других арбовирусов

IMR-32

Культура клеток нейробластомы человека

Среда Игла (МЭМ) +10% эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип 2n=(42— 51) хромосома, модальный класс — 49 хромосом. Маркеры: 2 субметацентрика, отсутствует 16-я хромосома, 2экстрахромосомы в группе С

Г-6-ФД, тип В

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита, герпеса человека

-Ill

Культура клеток крови больного моноцитарной лейкемией

Среда Игла + 20 % телячьей сыворотки

Гипердиплоидный нестабильный Кариотип 2n=(100—211) хромосом. Большая субметацентрическая маркерная хромосома

Г-6-ФД, тип В

Вирусы полиомиелита,

везикулярного стоматита, аденовирус человека, тип 3

Jijove

P-2003

Культура клеток асцитной жидкости больного лимфомой Беркитта (печени)

Среда RPMI +

+ 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип, модальный класс 2n=46 хромосом. Маркерная хромосома в группе D

Г-6-ФД,

тип В

Линия содержит вирус Эпстайна—Барра

KB

Культура клеток эпидермоидной карциномы полости рта человека

Среда Игла (МЭМ) +5% телячьей сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип без модального класса и маркерных хромосом

Г-6-ФД, тип А

Вирусы полиомиелита, вирусы Коксаки ; А, тип 20, 21, 23, Коксаки В, тип 1 — 6, ECHO, тип 28, ящура, энцефаломиокардита, парагриппа, тип 1 — 3, паротита, кори, респираторно-синцитиальный , бешенства, герпеса человека, осповакцины, аденовирусов человека, тип 1 — 30, ряд арбовирусов

L-132

Культура клеток легких эмбриона человека

Среда 199 + 20% телячьей сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип без модального класса

Г-6-ФД,

тип А

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита, аденовирус человека, тип 3

NCTC

2544

Культура клеток эпителия кожи человека

Среда NCTC +

+ 10 % лошадиной сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип без выраженного модального класса. Маркерные хромосомы: большой с убметацентрик, больше хромосомы 1, большой субтелоцентрик, больше хромосомы 4; большой телоцентрик, больше хромосомы 13

Г-6-ФД,

тип А

Вирусы полиомиелита

RAJ I

Культура лимфобластоподобных клеток больного лимфомой Беркитта

Среда RPMI + + 10%) эмбриональной телячьей сыворотки

Модальный класс диплоидный 2n=46 хромосом, 6% полиплоидных клеток

Г-6-ФД,  тип В

Слабочувствительны к заражению вирусами полиомиелита и везикулярного стоматита

RD

Культура клеток эмбриональной рабдомиосаркомы человека

Среда Игла (МЭМ) с двойным набором аминокислот и витаминов + 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Кариотип нестабильный гипердиплоидный

Г-6-ФД, тип В

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита, герпеса человека, оспы

WISH

Культура клеток амниона человека

Среда Игла +

+ 15%) эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип с частыми структурнымианомалиями

Г-6-ФД, тип А

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита, аденовирус человека, тип 3

WI-38

Диплоидная культура клеток эмбрионального легкого

Среда Игла + 10 % эмбриональной телячьей сыворотки

Модальный класс представляют клетки с диплоидным набором 2n = 46 хромосом

Г-6-ФД, тип В

Вирусы полиомиелита, везикулярного стоматита, герпеса человека и свиньи

Культуры клеток обезьяны

BSC-I

Культура клеток почки африканской зеленой мартышки

Среда Игла (МЭМ) + 10%) эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип 2n=(52—110) хромосом. Большая субметацентрическая хромосомамаркер

Методом иммунофлюоресценции определена видовая принадлежность

Вирусы полиомиелита, Коксаки А, тип 7, 9, 10, 14, 16, 23, Коксаки В, тип 1 — 6, ECHO, тип 1—9, 11 — 14, 17—22, 24—30, реовирусы, вирусы парагриппа, респираторно-синцитиальный , кори, краснухи, герпеса человека, ветряной оспы, SV40, везикулярного стоматита

CV-I

Культура клеток почки африканской зеленой мартышки

Среда Игла (МЭМ) + 10%) эмбриональной телячьей сыворотки

Модальный класс диплоидный 2n=60 хромосом

Методом иммунофлюоресценции определена видовая принадлежность

Вирусы полиомиелита, SV40, калифорнийского энцефалита, герпеса человека

LLC-MC2

Культура клеток почки макаки резуса

Среда 199 + 1% лошадиной сыворотки

Гипердиплоидный

Кариотип

Методом иммунофлюоресценции определена видовая принадлежность

Вирусы полиомиелита, Коксаки А, тип 9, 23, Коксаки В, тип 1 — 6, ECHO, тип 1 — 9, 11 — 32, парагриппа, тип 2, з’ паротита, кори, респираторно-синцитиальный , герпеса обезьян и свиньи и др.

'VERO

Культура клеток почки африканской зеленой мартышки

Среда 199 + 5% эмбриональной телячьей сыворотки

Гиподиплоидный

Кариотип

То же

Вирусы полиомиелита, Коксаки А, тип 7, 9, 11, 23, Коксаки В, тип 1—6, ECHO, тип 1 — 4, 6—10, 13, 14, 16—26, 30, аденовирусы человека, тип 1 —12, 14, 16, 18, 21, 31, гриппа человека А и В, реовирусы, вирусы парагриппа, кори, респираторносинцитиальный, герпеса человека, ветряной оспы, цитомегалии, краснухи, осповакцины, арбовирусы и др.

Культуры клеток мыши

AtT-20

Культура клеток опухоли гипофиза мыши

Среда F-10 (Хэма) + 15% лошадиной сыворотки + 4- 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки

Модальный класс диплоидный 2n=40 хромосом

Секретирует

адренокорти

котропный

гормон

Вирус везикулярного стоматита

1-10

Культура клеток тестикулярной опухоли мыши

Среда F-10 (Хэма) + 15% лошадиной сыворотки +

+ 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный Кариотип 2n=(12—89) хромосом, модальный класс — 45—46 хромосом, маркерные хромосомы

Секретирует дельта 4—4, 3-кетостероиды

Вирус везикулярного стоматита, герпеса человека

L

(NCTC-

929)

Культура клеток фибробластов подкожной соединительной ткани мыши C3H

Среда 199-4- 10% сыворотки крупного рогатого скота

Гипердиплоидный Кариотип 2n=(56—82) хромосом, модальный класс — 64 — 66 хромосом

Подтверждается видовая принадлежность по тесту гемагглютинации

5,9 х 106 клеток, инъецированных внутрибрюшинно мышам C3H/HeN, индуцируют у облученных доноров саркомы (в 11 случаях из 18)

Вирусы Коксаки А, тип 16, паротита, осповакцины, герпеса человека и свиньи, болезни Ньюкасла, лимфоцитарного хориоменингита, энцефаломиокардита, ряд арбовирусов (везикулярного стоматита, клещевого энцефалита, желтой лихорадки и др.)

МОРС-31 с

Культура клеток плазмоцитомы мыши

Среда Лейбовича (L-15) + 20% сыворотки новорожденных телят

Гипердиплоидный Кариотип, содержат маркерную хромосому среднего размера

Подтверждается видовая принадлежность микроиммунодиффузией в агаре. СекретируетIgG1

Neu го-2<с 1300)

Культура клеток нейробластомы мыши

Среда Игла (МЭМ) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный нестабильный Кариотип

Подтверждается видовая принадлежность

4 X 10« клеток, инъецированных подкожно, через 7 дней индуцируют опухоли в 100% случаев у мышей линии А

Вирусы везикулярного стоматита, герпеса человека

RAG

Культура клеток почечной аденокарциномы мыши

Среда Игла (МЭМ) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный набор хромосом

Неинвертируемая 8-азагуанинустойчивая линия, синтезирует почечную эстеразу ES-2

Вирусы везикулярного стоматита, герпеса человека

TCMK-1

Культура клеток почки мыши, трансформированной вирусом SV40

Среда Игла (МЭМ) +0,1%) гидролизата лактальбумина +

+ 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный набор хромосом

100% клеток обнаруживают Т-антиген и 2 % клеток — антигены вируса SV40

Вирус везикулярного* стоматита

3T3

Swiss

albino

Культура эмбриональных фибробластов мыши

Среда Дульбекко—Фогт + 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Модальный класс клеток гипотетраплоидный

Высокая способность контактного ингибирования роста

Вирусы герпеса человека, везикулярнога стоматита

3T6

Swiss

albino

Культура эмбриональных фибробластов мыши

Среда Дульбекко—Фогт +10% эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный нестабильный Кариотип

Секретирует коллаген и гиалуроновую кислоту

Вирусы везикулярного стоматита, герпеса человека и свиньи

Y-l

Культура клеток опухоли коры надпочечников мыши

Среда F-10 (Хэма) + 15% лошадиной сыворотки + + 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный набор хромосом

Секретирует стероидные гормоны

Вирусы везикулярного стоматита, герпеса человека и свиньи

Культуры клеток хомяка

BHK-21

Диплоидная культура клеток почки новорожденных сирийских хомячков

Среда Игла +

+ 10% трипозофосфатного бульона + 10% телячьей эмбриональной сыворотки

Модальный класс клеток диплоидный 2n=44 хромосомы

Подтверждается видовая принадлежность иммунофлюоресцентным методом

Вирусы Коксаки В, тип-3, осповакцины, ящура* энцефаломиокардита, гриппа человека А и В,, парагриппа, паротита, бешенства, болезни Ньюкасла, аденовирусов человека, тип 2, 5, 12,. герпеса человека и свиньи, реовирус, тип 3, SV40, многие арбовирусы

CHO-K1

Культура овариальных клеток китайского хомячка

Среда F12 + 10% эмбриональной телячьей сыворотки

Модальный класс клеток гиподиплоидный 2n=20 хромосом

Ауксотрофные мутанты по пролину

Вирус везикулярного стоматита

Don

Диплоидная культура клеток легкого китайского хомячка

Среда Пака N — 16 + 20% телячьей сыворотки

Диплоидный набор 2n=22хромосомы

Подтверждается видовая принадлежностьИммунофлюоресцентный методом

Вирус везикулярного стоматита

Культуры клеток крысы

Культура клеток опухоли глии, индуцированной N-нитрозометилмочевиной у крысы

Среда Г-10 (Хэма) + 15 % эмбриональной телячьей сыворотки

Модальный класс клеток диплоидный 2n=42 хромосомы, встречаются клетки со структурными нарушениями

Секретирует S—100 белок. Подтверждается видовая принадлежность

Вирусы везикулярного стоматита, герпеса чело-века, осповакцины

GH1

Культура клеток опухоли гипофиза крысы

Среда F-10 (Хэма) + 15% лошадиной сыворотки + + 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки

Модальный класс клеток гиподиплоидный . Маркеры — большой метацентрик и 2микрохромосомы

Секретирует гормоны роста. Подтверждается видовая принадлежность

Вирусы везикулярного стоматита, герпеса человека и свиньи

Jensen Sarcoma

Культура клеток саркомы Йенсена крысы

Среда Мак-Коя + + 5% сыворотки крупного рогатого скота

Модальный класс клеток гипердиплоидный 2n=(54—60) хромосом

Подтверждается видовая принадлежность

Вирусы везикулярнога стоматита

NH1C1

Культура эпителиальных клеток (гепатома Моррисона) крысы

Среда F-10 (Хэма) + 15% лошадиной сыворотки + 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки

Гипердиплоидный нестабильный Кариотип 2n=(43—97) хромосом

Продуцирует крысиный альбумин

Вирусы везикулярного стоматита, герпеса человека

— Означает отсутствие данных по этому вопросу.



Библиография: Голубев Д. Б., Соминина А. А. и Mедведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии, Л., 1976, библиогр.; Иранов С. Д. и Хесин Я. Е. Органные культуры в вирусологических исследованиях, М., 1977, библиогр.: Культура нервной ткани, под ред. Ю. М. Жаботинского, М., 1977, библиогр.; Новые методы культуры животных тканей, пер. с англ., под ред. Ю. М. Оленова, М., 1976; П о л Д. Культура клеток и тканей, пер. с англ., М., 1963; Руководство по культивированию нервной ткани, под ред. Б. Н. Вепринце-ва, М., 1976, библиогр.; X л о п и н Н. Г. Культура тканей, Л., 1940; о н ж е, Общебиологические и экспериментальные основы гистологии, Л., 1946, библиогр.; Э ф р у с с и Б. Гибридизация соматических клеток, пер. с англ., М., 1976, библиогр.; Cells and tissues in culture, ed. by E. N. Willmer, v. 1—2, L.—N. Y., 1965; D u 1 b e с с o R. Topoinhibition and serum requirment of transformed and untra-nsformed cells, Nature (Lond.), v. 227, p. 802, 1970;HayflickL. a. Moorhead P. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains, Symp. Int. Soc. Cell Biol., v. 3, p. 155, N. Y.—L., 1964; L a-v a p p a K. S. Survey of ATCC of human cell lines for HeLa contamination, In vitro, v. 14, p. 465, 1978; Readings in mammalian cell cultures, ed. by R. Pollack, N. Y., 1975; Tissue cultures, ed. by P. F. Kruse а. М. K. Patterson, N. Y., 1973. К. к. u т. в радиобиологии — Бочков H. П. Хромосомы человека и облучение, М., 1971, библиогр.; К о р о г о-д и н В. И. Проблемы пострадиационного восстановления, М., 1966, библиогр.; О к а д а Ш. Радиационная биохимия клетки, пер. с англ., „М., 1974.

К. к. и т. в онкологии — Васильев Ю. М. и Маленков А. Г. Клеточная поверхность и реакции клетки, Л., 1968, библиогр.; Тимофеевская Е. А. Оценка действия противоопухолевых препаратов в культуре тканей, Вестн. АМН СССР, № 9, с. 70, 1966; Тимофе-е в с к и й А. Д. Эксплантация опухолей человека, М., 1947, библиогр.; он же, Длительные культуры ткани и малигнизация клеток, * Вестн. АМН СССР, № 11, с. 3, 1964; Франкфурт О. С. Клеточные механизмы химиотерапии опухолей, М., 1976, библиогр.; III а б а д Л. М., Колесниченко Т. С. и Сорокина Ю. Д. Трансплацентарный бластомогенез и органные культуры, М., 1975; Advances in tissue culture, ed. by С. Waymouth, Baltimore, 1970; Aktuelle Probleme der Zellzuchtung, hrsg. v. B. Mauersberger, Jena, 1971; Harris M. Cell culture and somatic variation, N. Y., 1964; Human tumours in short term culture, ed. by P. P. Dendy, L.—N. Y., 1976.

Культивирование костного мозга — Лурия E. А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах, М., 1972, библиогр.; Чертков И. Л. и Ф р и д e н-штейн А. Я. Клеточные основы кроветворения (Кроветворные клетки-предшественники), М., 1977; Metcalf D. Hemopoietic colonies, in vitro cloning of normal and leukemic cells, B., 1977, bibliogr.; Metcalf D. a. M o o r e М. A. S. Haemopoie-tic cells, Amsterdam — L., 1971; Murray M. R. a. K o p e с h G. A bibliography of the research in tissue culture, 1884 to 1950, v. 1—2, L.—N. Y., 1953.




Популярные статьи

Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание

Поделиться: