ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ

ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ (син. электрофокусирование) — миграция молекул амфолита в градиенте значений pH под действием постоянного напряжения в область с величиной pH, соответствующей изоэлектрической точке исследуемого вещества; является важным методом фракционирования белков, получившим особенное распространение после того, как в 1967— 1968 гг. были созданы синтетические амфолиты-носители, с помощью которых стало возможным создавать градиент pH; метод широко используется в химии для аналитического и препаративного разделения белков.

Схема, иллюстрирующая принцип электрофокусирования положительно заряженной (+) , отрицательно заряженной (-) и нейтральной (±) молекул гипотетического белка e изоэлектрической точкой (pI) при pH 6,0: наверху рисунка анод +, внизу — катод —; (+) — молекулы белка в области колонки, где величина pH ниже их изоэлектрической точки; (-) — молекулы белка в области колонки, где величина pH выше их изоэлектрической точки; (±) — молекулы этого же белка, сфокусированные в изоэлектрической точке.

Каждый белок обладает свойствами амфотерного электролита (см. Амфолиты), и его заряд определяется величиной pH окружающей среды. В зависимости от pH среды суммарный заряд белковой молекулы может быть отрицательным, положительным или равняться нулю. Значение pH, при к-ром суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, называется изоэлектрической точкой (см.) данного амфолита. Условное обозначение изоэлектрической точки — pi (point isoelectric). Схематическое поведение белковой молекулы при И. ф. показано на рисунке: гипотетический белок с pI 6.0 помещен в колонку, в к-рой создан градиент значений pH от 3,0 до 10,0. Через колонку проходит постоянный электрический ток, причем анод расположен вверху колонки, а катод — внизу. Молекулы выделяемого белка в той области колонки, где величина pH ниже их pi, заряжены положительно и перемещаются в направлении сверху вниз; молекулы белка в области той части колонки, где величина pH выше pi, заряжены отрицательно и мигрируют снизу вверх. В итоге весь белок оказывается сконцентрированным (или сфокусированным) в той зоне, где pH равен величине его изоэлектрической точки. В таком состоянии молекулы белка остаются до тех пор, пока сохраняется градиент pH и на электроды подается напряжение. Аналогичным образом компоненты гетерогенной смеси белков будут распределяться вдоль изофокусирующей колонки в виде набора зон в порядке расположения их изоэлектрических точек. Следует особо подчеркнуть различие между И. ф. и электрофорезом (см.). При электрофорезе белки распределяются по величине молекул и их суммарному электрическому заряду при данном (одном) значении pH. Существенное преимущество И. ф. по сравнению с другими методами фракционирования состоит в том, что в ходе разделения зона белка сжимается, поскольку действующие силы стремятся уменьшить размывание зон вследствие диффузии.

Градиент pH при электрофокусировании создается благодаря применению синтетических амфолитов-носителей, которые представляют собой гетерогенную смесь различных полиамино-поликарбоновых к-т с мол. весом не более 1000 и общей формулой:

где R — (CH2)xCOOH, a m, n и p<5.

Аминогруппа может быть первичной, вторичной и третичной. Синтетические амфолиты-носители, выпускаемые швед, фирмой LKB, получили название амфолинов и поставляются в виде 40% водных р-ров (по 25 мл) с различным диапазоном pH (от 3 до 10; от 3 до 6; от 5 до 8; от 7 до 10; от 3 до 5; от 4 до 6; от 5 до 7; от 6 до 8; от 7 до 9; от 8 до 10). Амфолины с более узким диапазоном значений pH можно приготовить самостоятельно из коммерческих амфолинов на обычной колонке для электро-фокусирования.

Для стабилизации среды при И. ф. в колонке создается градиент плотности р-ра сахарозы (И. ф. в градиенте плотности) или И. ф. проводят в трубках с полиакриламидным гелем (И. ф. в геле), содержащим амфолиты-носители.

С помощью метода И. ф. можно разделять белки, отличающиеся по величине своих изоэлектрических точек на 0,01 — 0,02 единицы pH. Метод И. ф. является одним из наиболее эффективных методов разделения самых различных белков и находит самое широкое применение в практике биохим. и медико-биохим. лабораторий.


Библиография: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков, пер. с англ., под ред. Ю. А. Овчинникова, с. 297, М., 1974, библиогр.; H i g h e t t i P. G. a. Drysdale J. W. Isoelectric focusing, в кн.: Lab. techn. in biochem. a. mol. biol., ed. by T. S. Work a. E. Work, v. 5, pt 2, Amsterdam— N. Y., 1976.


Популярные статьи

Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание

Поделиться: